枯草芽孢桿菌發酵玉米黃粉制備可溶性肽

陳丹陽，張振洋，黎劍，王志翠，徐立華，孫付保*

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122) 2(紐綏笙特殊醫用食品江蘇有限公司，江蘇 泰州，225300)

玉米黃粉(corn gluten meal,CGM)是玉米濕法生產淀粉的主要副產物[1]，其蛋白含量高達60%，是一種具有極大開發價值的蛋白資源[2-5]。但由于玉米蛋白不溶于水且氨基酸組成不均衡，目前玉米黃粉在我國主要用于低值粗飼料生產或自然排放，造成蛋白質資源的極大浪費和環境污染[6-8]。若將玉米黃粉開發成玉米肽等高附加值產品，將能大幅度提升玉米深加工企業的經濟效益[9]。玉米肽是玉米蛋白經過水解得到的分子質量小且可溶于水的肽混合物，其組成包含分子質量大小不一的玉米多肽、低聚肽以及少量氨基酸。現代營養學研究表明與蛋白質和氨基酸相比，肽類物質特別是低聚肽(分子質量≤1 000 Da)更容易被機體吸收利用[10-11]。

目前制備玉米肽的方法主要有酶解法和微生物發酵法，其中酶解法是制備玉米肽最常用的方法。陳芳[12]利用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶雙酶水解底物質量濃度為50 g/L的玉米黃粉，得到可溶性肽含量為21 g/L，其中低聚肽含量占比67.1%；楊弈[13]利用微波協同堿性蛋白酶酶解底物質量濃度為90 g/L的玉米蛋白，得到可溶性肽含量為1.71 g/L；張學忠[14]利用堿性蛋白酶酶解底物質量濃度為100 g/L的玉米蛋白，得到可溶性肽含量為26.19 g/L，低聚肽含量占比高達75%。雖然酶解法已經得到廣泛的應用，但酶解法制備玉米肽對原料要求較高，酶制劑價格高昂，且酶解結束后玉米肽常出現嚴重苦味，而去除玉米肽苦味的程序繁瑣且成本較高，這些都限制了酶解法制備玉米肽在發展中國家的工業化擴大生產。

與酶解法相比，微生物發酵法是通過微生物發酵過程中分泌的蛋白酶將原料蛋白水解為小分子肽，是一個微生物產酶和蛋白水解同步進行的過程。在發酵過程中微生物通過自身的代謝將小肽之間的肽鍵重排轉接，對某些苦味基團進行修飾、轉移和重組，小肽氨基酸又經過同化代謝作用，最終轉化為具有生物活性的玉米肽[15]。但是，目前國內外對微生物發酵法制備玉米肽的報道還很少。基于此，本文利用產蛋白酶豐富的枯草芽孢桿菌發酵玉米黃粉制備玉米可溶性肽，建立較優發酵工藝參數并對發酵所得可溶性肽的理化性質進行分析。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

枯草芽孢桿菌(BacillussubtilusCICC 20030)，中國工業微生物菌種保藏管理中心；玉米黃粉(蛋白含量60%)，購于山東百盛生物科技有限公司；市售玉米肽和市售大豆肽，購于湖北瑞邦生物有限公司；鄰菲羅啉、鄰苯三酚、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼均為分析純，購自美國Sigma公司。

1.2 培養基

菌種活化固體培養基(g/L)：蛋白胨5.0，牛肉浸取物3.0，NaCl 5.0，瓊脂15.0，蒸餾水1.0 L，pH 7.0；

液體種子培養基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母膏5.0， NaCl 10.0，蒸餾水1.0 L，pH 7.0。

1.3 儀器與設備

UV-3200型分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；MICROMAX RF230型離心機，美國Thermo Fisher公司；HPX-9052MBE型數顯電熱培養箱，上海博訊實業有限公司；HYL-C3型三層搖床，太倉市強樂實驗設備有限公司；chromaster CM5110型日立高效液相色譜儀，日本日立公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 種子液的制備

用接種環挑取菌種接于裝有50 mL種子培養基的250 mL錐形瓶中，在37 ℃、220 r/min的條件下振蕩培養18 h，待用。

1.4.2 發酵培養基優化

玉米黃粉發酵前進行脫淀粉處理[16]，脫淀粉玉米黃粉(destarch comgluten meal,DCGM)蛋白含量為80.09%。枯草芽孢桿菌發酵DCGM條件為：以發酵培養基初始pH 7.0和接種量6%，在溫度37 ℃和轉速220 r/min條件下發酵48 h。

(1)單因素實驗

選擇DCGM添加量分別為10、30、50、70、90 g/L，以篩選最適DCGM添加量。考察碳源時，發酵培養基中DCGM添加量70 g/L，碳源包括葡萄糖、蔗糖、麥芽糖，添加量分別為2、4、6、8、10 g/L。選擇無機鹽時，發酵培養基中添加DCGM 70 g/L和蔗糖8 g/L，分別檢測NaCl、CaCl2、KCl、MgSO4、 MnSO4等無機鹽添加量為2、4、6、8、10 g/L時發酵48 h的玉米可溶性肽含量。

(2)發酵培養基的響應面優化

在上述單因素實驗基礎上，實驗根據Box-Behnken中心組合試驗選擇玉米黃粉添加量(A)、蔗糖添加量(B)、NaCl添加量(C)3個因子作為自變量，進行發酵培養基組分優化。

1.4.3 培養條件優化

本實驗以上述最佳發酵培養基在接種量6%、發酵初始pH 7.0、培養溫度37 ℃、轉速220 r/min等基礎培養條件下考察發酵時間、接種量、發酵溫度和轉速等對玉米可溶性肽發酵產量的影響。

(1)單因素實驗

選擇發酵時間，在上述發酵過程中于24、36、48、60、72、84 h取樣檢測。在選擇發酵初始pH時，維持其他條件不變，僅改變發酵初始pH值分別為6.0、7.0、 8.0、9.0、10.0、11.0。在選擇接種量時調節發酵培養基pH值為8.0，僅改變上述基礎發酵條件接種量分別為2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%。在選擇發酵溫度時培養基初始pH 8.0和4%接種量，設置發酵溫度分別為29、33、37、41、45 ℃時研究發酵溫度對產玉米可溶性肽含量的影響。選擇發酵轉速時培養基初始pH 8.0、4%接種量和發酵溫度37 ℃，分別考察140、180、220、240、260 r/min時產玉米可溶性肽含量。

(2) 發酵培養條件的響應面優化

實驗接著在上述單因素實驗基礎上，按照Box-Behnken中心組合試驗對玉米可溶性肽產量影響較大的3個因素(發酵時間(A)、發酵pH(B)、發酵溫度(C)為自變量)進行發酵培養條件優化。

1.4.4 可溶性肽含量的測定

可溶性肽溶液：將發酵液進行離心分離(8 000 r/min,10 min)，去除玉米黃粉殘渣和菌體，得到發酵上清液。將發酵上清液進行適當稀釋用于可溶性肽含量的檢測。采用考馬斯亮藍顯色法進行可溶性肽含量的測定[17]。

1.4.5 肽分子質量分布的測定

采用高效液相色譜法進行分子質量分布的測定。色譜條件：TSK gel 2000 SWXL(7.8 mm×300 mm)色譜柱；檢測波長：220 nm；流動相∶V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=40∶60 ∶0.1；流速:0.5 mL/min；柱溫：30 ℃； 進樣體積：20 μL。

1.4.6 肽抗氧化活性的檢測

將本實驗所制備玉米可溶性肽配制成2 g/L的肽溶液，而后進行自由基清除能力檢測以評估其抗氧化活性。玉米可溶性肽·OH清除能力測定采用涂勇剛等[18]的方法；O2-·清除能力測定采用鄰苯三酚自氧化方法，具體操作步驟采用劉建華[19]的方法；DPPH·清除能力測定方法采用CHEN等[20]的方法。

1.4.7 統計方法

利用Excel進行數據統計處理，測定結果以均值±標準差表示。采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 發酵培養基組成對可溶性肽發酵產量的影響

2.1.1 發酵培養基組成的單因素優化

本實驗對發酵培養基組成中的DCGM添加量、碳源種類及添加量、無機鹽種類及添加量進行了單因素優化，實驗結果見圖1-a～圖1-c。

a-DCGM添加量；b-碳源添加量；c-無機鹽添加量圖1 發酵培養基組成對可溶性肽含量的影響Fig.1 Effect of fermentation medium composition on soluble peptide content

由圖1-a可知，當DCGM添加量為90和70 g/L時，在發酵過程中可溶性肽含量均優于其他水平添加量。其中在發酵48 h時可溶性肽含量達到最高，DCGM添加量為90 g/L時，可溶性肽含量為1.79 g/L；DCGM添加量為70 g/L時，可溶性蛋白含量為1.71 g/L，考慮到蛋白轉化率和發酵培養基黏度選擇DCGM添加量為70 g/L。

由圖1-b可知，當以蔗糖為碳源且蔗糖的添加量為8 g/L時，可溶性肽含量達到4.8 g/L，高于蔗糖其他添加量以及以葡萄糖、麥芽糖為碳源時可溶性肽含量。因此選擇蔗糖添加量為8 g/L。

由圖1-c可知，當添加無機鹽為CaCl2、KCl、MgSO4、MnSO4時，發酵液中可溶性肽含量不足4.0 g/L，與未添加無機鹽時可溶性肽含量4.80 g/L相比有所降低，顯示CaCl2、KCl、MgSO4、MnSO4對DCGM發酵產可溶性肽均有抑制作用，表明發酵過程無需添加這些無機鹽。以NaCl作為無機鹽時，NaCl添加量低于5 g/L時，對可溶性肽含量的增加有促進作用，其中NaCl添加量為1 g/L時，對可溶性肽含量的提升促進作用最為明顯，此時可溶性肽含量可達5.66 g/L；當NaCl添加量高于5 g/L時，可溶性肽含量隨著NaCl添加量的增加而有所下降。因此，實驗選擇NaCl為無機鹽且添加量為1 g/L。

2.1.2 發酵培養基組成的響應面優化

根據Box-Behnken設計原理，進行17組發酵培養條件優化試驗，結果見表1。利用Design-Expert 8.0.6軟件對所得實驗數據進行回歸分析，得到二次多項回歸方程：Y可溶性肽=-58.84+ 4.16×A+147.35×B-248.79×C-4.02×AB+14.75×AC+210.00×BC-0.14×A2-86.729×B2-1.99×C2。

表1 響應面分析實驗及實驗結果Table 1 Experiments and experimental results of response surface methodology

通過單因素選擇和響應面優化，實驗最終得到最佳發酵培養基的重要組成：DCGM添加量100 g/L，蔗糖添加量8 g/L，NaCl添加量1.5 g/L，此時得到可溶性肽含量為9.20 g/L。與發酵培養基優化前相比，可溶性肽產量提升為優化前5.38倍。

2.2 培養條件對可溶性肽發酵含量的影響

2.2.1 發酵培養條件的單因素優化

本實驗對發酵培養條件中的發酵時間、發酵初始pH、接種量、發酵溫度及發酵轉速進行了單因素優化，實驗結果見圖2-a～圖2-e。

a-發酵時間;b-發酵pH;c-接種量；d-發酵溫度;e-發酵轉速圖2 發酵培養條件對可溶性肽含量的影響Fig.2 Effect of fermentation conditions on soluble peptide content

由圖2-a所示，在發酵初始階段，隨著發酵時間的增加可溶性肽含量隨之提升；在發酵36 h可溶性肽含量達到最高值為10.51 g/L，隨后可溶性肽含量隨著發酵時間的增加趨于穩定。因此，選擇發酵時長為36 h。

由圖2-b所示，在初始pH<8時，隨著初始pH的增大可溶性肽含量隨之增加；在pH>8時，隨著培養基初始pH的增大，可溶性肽含量隨之降低；在培養基初始pH=8時，可溶性肽含量達到最高為14.23 g/L。 因此，選擇培養基初始pH為8。

由圖2-c所示，在接種量<4%時，隨著接種量的增大可溶性肽的含量不斷增加；在接種量>4%時，隨著接種量的增大可溶性肽含量逐漸降低；在接菌量為4%時，可溶性肽含量達到最高為15.47 g/L。因此，選擇發酵接種量為4%。

由圖2-d所示，在發酵溫度<37 ℃時，隨著發酵溫度的增加，可溶性肽的含量不斷增加；在發酵溫度>37 ℃ 時，隨著發酵溫度的增加可溶性肽含量隨之降低，在發酵溫度為37 ℃時，可溶性肽含量達到最高。因此，選擇發酵溫度為37 ℃。

由圖2-e所示，在發酵轉速<180 r/min時，隨著轉速的增加可溶性肽含量不斷增加；在發酵轉速>180 r/min時，隨著轉速的增加可溶性肽含量逐漸降低；在發酵轉速為180 r/min時，可溶性肽含量達到最高，約達17.5 g/L。因此，選擇發酵轉速為180 r/min。

2.2.2 響應面優化發酵培養條件結果

根據Box-Behnken設計原理，進行17組發酵培養條件優化試驗，結果見表2。利用Design-Expert 8.0.6軟件對所得實驗數據進行回歸分析，得到二次多項回歸方程：Y可溶性肽=-308.04+0.345 93×A+38.595 96×B+8.789 23×C+0.022×AB+0.047×AC-0.071×BC-0.032×A2-2.049×B2-0.140×C2。

表2 響應面分析實驗及實驗結果Table 2 Experiments and experimental results of response surface methodology

目前國內對發酵法制備玉米肽的研究還較少。祁尼娜等[21]利用納豆芽孢桿菌發酵底物濃度10%的玉米黃粉，在34 ℃條件下發酵50 h得到可溶性肽含量為22.15 g/L；牟金秀[22]利用枯草芽孢桿菌發酵底物濃度5.89%玉米黃粉，在33 ℃條件下發酵85 h得到可溶性肽含量為22.90 g/L；宋占蘭[23]利用納豆芽孢桿菌發酵底物濃度13.5%玉米黃粉，在32 ℃條件下發酵42 h得到可溶性肽含量為12.84 g/L。與以上研究相比，本實驗所制備玉米肽的方法具有發酵可溶性肽產量較高，發酵耗時較短和發酵效率高的優勢。

2.3 玉米可溶性肽的理化性質分析

2.3.1 分子質量分布

表3分析檢測最佳發酵條件下制備的玉米可溶性肽分子質量分布。該可溶性肽中分子質量<1 000 Da低聚肽含量較高，占總肽含量的76.36%。相似地，陳芳[12]、張學忠[14]和權文吉[24]利用酶法所制備玉米肽中低聚肽含量占比分別為67.1%、75%和63%。與這些報道相比，本實驗利用發酵法制備的玉米肽在低聚肽含量上處于較高水平。

表3 可溶性肽分子質量分布Table 3 Soluble peptide molecular weight distribution

2.3.2 玉米可溶性肽抗氧化活性檢測

實驗接著對所制備玉米肽進行抗氧化活性(·OH、O2-· 及DPPH·清除能力)檢測，結果見表4。發酵法所制備的玉米肽對·OH清除率為99.31%、O2-·清除率為58.38%和DPPH·清除率為80.27%。與市售玉米肽和大豆肽相比，發酵玉米肽對3種自由基清除能力均優于市售玉米肽和大豆肽。該分析顯示，發酵制備的玉米肽具有很高的抗氧化性，意味著該活性肽可能具有重要的生理功能，值得將來進一步研究。

表4 抗氧化能力的檢測Table 4 Determination of antioxidant activity of peptides

3 結論

經過對玉米黃粉添加量、碳源及無機鹽種類和添加量、發酵時間、發酵pH、接種量、發酵溫度、發酵轉速等相關因素的單因素和響應面綜合試驗，確定利用枯草芽孢桿菌CICC20030發酵生產可溶性肽的最佳發酵條件為：玉米黃粉添加量100 g/L，蔗糖添加量8 g/L，NaCl添加量1.0 g/L，發酵時間42 h，培養基初始pH 9.0，發酵溫度37 ℃，接種量4%，發酵轉速 180 r/min。在此條件下得到的可溶性肽含量為22.7 g/L， 是優化前產量的8倍。在最佳發酵條件下所制備的玉米肽中低聚肽含量較高，占玉米肽總含量的76.36%。同時對最佳發酵條件下所制備的玉米肽清除·OH、O2-·、DPPH·的能力進行檢測，檢測其對3種自由基的清除能力分別為99.31%、58.38%、80.27%，對3種自由基的清除能力均優于市售玉米肽及市售大豆肽。