枝睪闊盤吸蟲涼山州分離株nad4基因部分序列測定與種系發(fā)育分析

郝桂英 易利 潘用清

摘要? ? 為探究山羊源枝睪闊盤吸蟲的種內(nèi)遺傳變異和系統(tǒng)發(fā)育關系，對采集自四川省涼山州的5個吸蟲樣品nad4基因部分序列進行PCR擴增、序列測定及分析，并構建種系發(fā)育樹。測序結果顯示，所測得的5個山羊源枝睪闊盤吸蟲nad4基因部分序列長度均為789 bp，核苷酸同源性為99.5%～100.0%，共檢測到4個單倍型、4個變異位點。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，5個山羊源枝睪闊盤吸蟲涼山州分離株聚在同一小支上，未與胰闊盤吸蟲聚類在一支上，能與其他吸蟲相鑒別。本研究結果為枝睪闊盤吸蟲的分子分類和種群遺傳的進一步研究奠定了基礎。

關鍵詞? ? 枝睪闊盤吸蟲;山羊;nad4基因;種系發(fā)育

中圖分類號? ? S8-05? ? ? ? 文獻標識碼? ? A? ? ? ? 文章編號? ?1007-5739（2019）12-0200-02

Abstract? ? In order to study the genetic variations of Eurytrema cladorchis and the phylogentic relationships with other flukes，fragment of nad4 gene of 5 flukes isolated from Liangshan Prefecture in Sichuan Province were amplified by PCR，then analyzed the sequences，and the NJ tree was reconstructed.The results showed that the partial sequences of nad4 gene were 789 bp，with homology was 99.5%～100.0%，four haplotypes were detected in these sequences，with 4 variable sites.The phylogenetic tree showed that the isolates of E. cladorchis from goats in Liangshan were clustered in the same clade，which were not cluster together with E. pancreaticum，can be identified with other flukes.The results of this study could provide the foundation for further research on the molecular classification and population genetics of E. cladorchis.

Key words? ? Eurytrema cladorchis;goat;nad4 gene;phylogenetic

枝睪闊盤吸蟲（Eurytrema cladorchis）隸屬于吸蟲綱（Tr-ematoda）復殖目（Digenea）雙腔科（Dicrocoeliidae）闊盤屬（Eurytreama）[1]，在牛、羊等反芻動物胰腺胰管內(nèi)均有寄生，但不如胰闊盤吸蟲（E. pancreaticum）、腔闊盤吸蟲（E. coel-omaticum）常見[2]。闊盤屬吸蟲致病力低，常常在尸體剖檢或屠宰時發(fā)現(xiàn)。然而，它能導致動物生產(chǎn)性能降低，如體重減輕、產(chǎn)肉量減少，甚至死亡，給養(yǎng)殖業(yè)造成一定經(jīng)濟損失[3]。

對枝睪闊盤吸蟲的初步鑒定可通過觀察其形態(tài)學特征進行，但受環(huán)境、宿主等多種因素的影響，其可靠性、準確性受到一定的限制。DNA技術已被廣泛應用于寄生蟲的分類學研究，其中的DNA序列分析因操作簡便、結果準確、信息豐富等成為種系發(fā)生學和分類學的重要研究工具之一[4]。

nad4基因是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶亞單位4基因的簡稱，是線粒體上進化速率較快的一個基因，利用它作遺傳標記基因對寄生絳蟲和線蟲進行種群遺傳和分類研究已有報道[5-6]。但目前關于枝睪闊盤吸蟲分子分類的研究較少，僅見Mohanta等[7]對孟加拉共和國瘤牛源枝睪闊盤吸蟲的18S rRNA和ITS2進行了研究，未見nad4基因用于枝睪闊盤吸蟲分子鑒別的報道。

鑒于此，本研究對采自四川省涼山彝族自治州的5個山羊枝睪闊盤吸蟲樣品nad4基因部分序列（pnad4）進行PCR擴增和序列分析，并構建枝睪闊盤吸蟲與其他吸蟲的種系發(fā)育關系，從而明確nad4基因能否成為枝睪闊盤吸蟲理想的遺傳標記，以期為今后枝睪闊盤吸蟲的分子分類、種群遺傳結構研究奠定基礎。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗材料

1.1.1? ? 供試儀器。電子天平（型號為FA2204N），購自瑞安市安特稱重設備有限公司;高速離心機（型號為TDL-60B），購自上海安亭科學儀器廠;梯度基因擴增儀，購自德國Eppe-ndorf公司;水平電泳儀（型號為DYY-6C），購自北京市六一儀器廠;BIO-RAD Gel Doc XR+凝膠成像分析系統(tǒng)（型號為1708195），購自美國伯樂公司。

1.1.2? ? 供試試劑。蛋白酶K購自Merck公司，2×Taq PCR Master Mix、DL2000 DNA Marker、GreenView核酸染料、柱式DNA膠回收試劑盒等均購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2? ? 試驗方法

1.2.1? ?蟲體的采集及保存。從四川省涼山彝族自治州自然感染的5只山羊胰管內(nèi)采集枝睪闊盤吸蟲樣品，用滅菌生理鹽水清洗干凈，進行形態(tài)學鑒定后，分別編號為LS01～LS05，于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩Ｍ恢簧窖蚍蛛x出的枝睪闊盤吸蟲為1個分離株。

1.2.2? ? 枝睪闊盤吸蟲蟲體總DNA提取。從冷凍保存的5個山羊枝睪闊盤吸蟲樣品中分別隨機取出1條，用剪刀剪碎并研磨，加入1 μg/μL SDS裂解液和10 μg/μL蛋白酶K，放入56 ℃水浴鍋中消化過夜，然后將消化好的蟲體懸液用酚/氯仿法[8]提取蟲體總DNA，保存于-20 ℃條件下備用。

1.2.3? ? 枝睪闊盤吸蟲nad4基因擴增及序列測定。用Chang等[9]報道的引物進行枝睪闊盤吸蟲nad4基因部分序列的擴增。由上海杰李生物技術有限公司合成引物序列，引物序列如下：nad4P1為5′-GTT TTG ATG TTT TTA TGA GT-3′;nad4P2為5′-CTA ATA TGA CGA ACC AGG AA-3′。PCR擴增體系為50 μL：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，引物nad4P1、nad4P2（10 pmol/μL）各2 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 19 μL。同時，以ddH2O作空白對照。擴增條件：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性40 s，45 ℃復性40 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán);最后72 ℃延伸6 min。反應結束后分別取5 μL PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)檢測目的條帶的大小。各PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)柱式DNA膠回收試劑盒進行回收純化后送上海杰李生物技術有限公司測序。

1.2.4? ? 序列分析及系統(tǒng)進化分析。檢索GenBank收錄的部分吸蟲的nad4基因序列并下載（表1），然后用Clustal X 1.81軟件進行序列比對，MEGA 5.0軟件分析堿基組成，基于p-distance模型計算遺傳距離;用DNAstar 中的MegAlign程序進行序列同源性分析;用DnaSP 4.0軟件計算單倍型數(shù)（ha-plotypes，H）、核苷酸多樣性（Nucleotide diversity，Pi）、單倍型多樣性（Haplotypes diversity，Hd）和平均核苷酸差異（average number of nucleotide differences，K）。以豬帶絳蟲（Taenia soli-um，AB086256）作為系統(tǒng)發(fā)育分析的外群，采用p-distance模型，用MEGA 5.0軟件構建NJ樹，并進行重復1 000次的自舉檢驗（bootstrap test）。

2? ? 結果與分析

2.1? ? 枝睪闊盤吸蟲nad4基因部分序列的特征和同源性比較

比對校正剔除多余序列后，本研究測得的5個枝睪闊盤吸蟲涼山州分離株的nad4基因部分序列長度均為789 bp（占全長的61.7%），A+T堿基的平均含量為61.4%。5個測序序列均不存在堿基插入/缺失，其中保守位點785個，變異位點4個（簡約信息位點、單變異位點各2個）。核苷酸變異位點主要發(fā)生在密碼子第1位（占50%），第2位和第3位各占25%，且全為轉換（3個A-G、1個C-T），無顛換。

5個枝睪闊盤吸蟲涼山州分離株測序序列的同源性為99.5%～100.0%，堿基變異率為0～0.5%。5個測序序列與胰闊盤吸蟲的同源性為85.8%～85.9%，與矛形雙腔吸蟲、中華雙腔吸蟲、華支睪吸蟲、大片吸蟲、鹿前后盤吸蟲的同源性均低于70%。

2.2? ? 遺傳多樣性分析

5個山羊源枝睪闊盤吸蟲的nad4基因部分序列共檢測到4個單倍型，遺傳距離為0～0.005（平均遺傳距離為0.003），與胰闊盤吸蟲的遺傳距離為0.402～0.406，與矛形雙腔吸蟲、中華雙腔吸蟲、華支睪吸蟲、大片吸蟲、鹿前后盤吸蟲的遺傳距離均≥0.493。5個測序序列總的單倍型多樣性（Hd）和核苷酸多樣性（Pi）分別為0.900和0.002 53，平均核苷酸差異（K）為2.000。

2.3? ? 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于nad4基因部分序列構建的NJ樹（圖1）顯示，5個山羊源枝睪闊盤吸蟲涼山州分離株單獨聚為一支，未與胰闊盤吸蟲聚在一支上，而胰闊盤吸蟲與中華雙腔吸蟲和矛形雙腔吸蟲聚類在同一小支上，與形態(tài)學分類的結果不一致。

3? ? 結論與討論

目前，對胰闊盤吸蟲和腔闊盤吸蟲的研究主要集中在蟲體形態(tài)結構、發(fā)育過程及闊盤吸蟲病的感染情況調查、診斷和綜合防治等傳統(tǒng)寄生蟲學方面，分子水平的研究較少。

用于胰闊盤吸蟲和腔闊盤吸蟲分子分類的靶分子主要有18S rRNA[13-15]、ITS-2[15]，雖然已有胰闊盤吸蟲線粒體基因組全序列的報道[9]，但并未見基于線粒體基因對胰闊盤吸蟲、腔闊盤吸蟲、枝睪闊盤吸蟲等進行分析的報道。

本研究對測序獲得的5個山羊源枝睪闊盤吸蟲涼山州分離株的nad4基因部分序列進行分析，發(fā)現(xiàn)其核苷酸同源性為99.5%～100.0%，平均遺傳距離為0.003，構建的進化樹顯示枝睪闊盤吸蟲涼山州樣品位于同一分支，與其他吸蟲得到了很好地鑒別。

本研究對采集自涼山州山羊源的枝睪闊盤吸蟲nad4基因的部分序列進行擴增和序列分析，結果表明，枝睪闊盤吸蟲的nad4基因部分序列種內(nèi)相對保守，種間差異加大，說明nad4序列片段可作為枝睪闊盤吸蟲種間鑒定及種內(nèi)遺傳變異研究的標記。研究結果為進一步研究枝睪闊盤吸蟲的分子分類、遺傳變異奠定了基礎。

4? ? 參考文獻

[1] 楊光友.獸醫(yī)寄生蟲病學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2015：73-76.

[2] 趙輝元.人獸共患寄生蟲病學[M].長春：東北朝鮮民族教育出版社，1998：236.

[3] IIHA M R，LORETTI A P，REIS A.Wasting and mortality in beef cattle parasitized by Eurytrema coelomaticum in the State of Paraná，southern Brazil[J].Vet Parasitol，2005，133（1）：49-60.

[4] MCMANUS D P，BOWLES J.Molecular genetic approaches to parasite identification：Their value in diagnostic parasitology and systematics[J].Int J Parasitol，1996，26（7）：687-704.

[5] 郝桂英.豬囊尾蚴西昌分離株線粒體Cytb和nad4基因的序列測定與種系發(fā)育分析[J].動物醫(yī)學進展，2015，36（5）：59-63.

[6] 王燕，楊言川，張悅文，等.羊毛尾線蟲線粒體nad4基因的序列變異分析[J].中國畜牧獸醫(yī)，2013，40（4）：81-84.

[7] MOHANTA U K，ICHIKAWA-SEKI M，HAYASHI K，et al. Morphologi-cal and molecular characterization of Eurytrema cladorchis parasitizing cattle（Bos indicus）in Bangladesh [J].Parasitol Res，2015，114（6）：2099-2105.

[8] SAMBROOK J，RUSSEL D W.Molecular cloning. A laboratory manual[M].3rd ed. New York，USA.Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001：463-470.

[9] CHANG Q C，LIU G H，GAO J F，et al.Sequencing and characterization of the complete mitochondrial genome from the pancreatic fluke Eurytrema pancreaticum（Trematoda：Dicrocoeliidae）[J].Gene，2016，576（1）：160-165.

[10] LIU G H，YAN H B，OTRANTO D，et al.Dicrocoelium chinensis and Dicrocoelium dendriticum （Trematoda：Digenea）are distinct lancet fluke species based on mitochondrial and nuclear ribosomal DNA sequences[J].Mol Phylogenet Evol，2014，79（1）：325-331.

[11] CAI X Q，LIU G H，SONG H Q，et al.Sequences and gene organization of the mitochondrial genomes of the liver flukes Opisthorchis viverrini and Clonorchis sinensis（Trematoda）[J].Parasitol Res，110（1）：235-243.

[12] LIU G H，GASSER R B，YOUNG N D，et al.Complete mitochondrial ge-nomes of the‘intermediate formof Fasciola and Fasciola gigantica，and their comparison with F.hepatica[J].Parasit Vectors，2014，7（1）：150.

[13] 鄭亞東，駱學農(nóng)，施程洪，等.腔闊盤吸蟲18S rRNA及親緣關系分析[J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志， 2006，24（5）：345-358.

[14] ZHENG Y，LUO X，JING Z，et al.Comparison of 18S ribosomal RNA gene sequences of Eurytrema coelmaticum and Eurytrema pancreaticum[J].Parasitol Res，2007，100（3）：645-646.

[15] 常巧呈，鄭旭，段紅，等.基于核糖體18S和ITS2序列探討胰闊盤吸蟲的分子進化地位[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學學報，2015，27（4）：50-53.