雙酚A對骨分化及骨密度的影響及相關機制

李奕豐 郭曉英

1.中國醫科大學臨床一系, 遼寧 沈陽 110122 2.中國醫科大學公衛學院，遼寧 沈陽 110122

雙酚A(bisphenol A，BPA)是一種已知的內分泌干擾物(endocrine-disrupting chemicals，EDCs)，廣泛存在于環境和日常用品中，如食物、飲料的碳酸聚酯包裝材料、金屬罐頭的樹脂內膜及其他產品的添加劑等。據報道一般人群血清中BPA濃度約為0.1～10 μmol/ L[1]。BPA與雌激素結構相似，能通過競爭結合雌激素受體調節或破壞內分泌系統，影響神經、生殖、免疫系統和代謝，與前列腺癌和乳腺癌、肥胖、骨質疏松等疾病密切相關[2]。

骨是一種對激素敏感的器官，骨骼的發育和重建受激素的精細調控。BPA通過與雌激素受體(estrogen receptor，ERs)和雄激素受體(androgen receptor，AR)結合，干擾內源性激素的穩態，抑制破骨細胞和成骨細胞分化并誘導細胞凋亡，降低血漿鈣水平，進而造成骨骼幾何形態、強度等方面的改變，甚至因骨代謝失常造成全身疾病[3]。本文就BPA對骨分化和骨密度影響及其機制作以綜述。

1 雙酚A暴露對骨分化及骨密度的影響

1.1骨分化。

骨骼的形成包括膜內成骨和軟骨內成骨。膜內成骨為間充質細胞經鈣化后直接成骨，多見于扁平骨，如顱蓋骨及面骨。軀干骨及四肢骨則是以軟骨內成骨方式形成，先形成軟骨雛形，隨之軟骨逐漸被替換，形成骨組織。BPA對膜內成骨的影響尚未見報道。目前BPA對軟骨內成骨的研究多集中在對股骨、椎體等的影響。骨重建的過程由成骨細胞及破骨細胞兩者的動態平衡實現，受雌激素的影響。因為不同骨齡、類型的骨骼中成骨細胞、破骨細胞和骨髓細胞的ERs各亞型的數量和比例不同，而BPA對各ERs亞型有不同的親和力。因此，特定的細胞類型和暴露的時間可能引起BPA對骨細胞的獨特反應，表現出高度的發育階段相關性及性別相關性[4]，且不同實驗條件(劑量、染毒時間、實驗對象)產生的效應不同。

以往的研究認為毒性水平的BPA以劑量依賴性方式(0.5～12.5 μmol/L)在體外有效抑制成骨細胞和破骨細胞的分化和活性，刺激兩種細胞的凋亡[2]。不同學者對不同發育階段的不同性別和品系鼠、采用不同劑量進行了BPA對股骨及椎體影響的研究。

Katherine等以10 μg/(kg.d) BPA灌胃C57BL/6 J小鼠，從妊娠第11天到產后第12天，結果顯示BPA增加股骨長度且在雄性中更具統計學意義，增強雄性而減弱雌性股骨抗扭承載力[4]。這種股骨長度增加和拉伸減少的綜合效應導致扭轉極限減小，這些結果提示了發育暴露于環境相關水平的PBA對骨分化的負面作用。由同一小組的兩項不同研究，則提示了不同劑量BPA對不同性別大鼠后代的骨分化的不同影響：對Wistar大鼠孕哺期染毒[0、25、250、5 000μg和50 000μg BPA/(kg.d) ]的結果為25和5 000μg的雌性后代股骨伸長分別為1.8%和2.1%，暴露于25μg BPA的雄性后代股骨干骨皮質顯著較厚(4.7%)[3]；更低劑量的研究發現，在妊娠3.5 d直到出生后第22天分別用0.5和50μg BPA/(kgBW.d)感染Fischer 344大鼠，5周齡時處死子代，結果提示雄性子代股骨分別變短2.2%和1.8%，降低了雄性子代總礦物質含量、總橫截面積、小梁面積、骨膜周長以及骨內膜周長，而對雌性無明顯作用[5]。此外，Auxietre等[6]在妊娠和哺乳期間口服給予雌性Wistar大鼠BPA，在出生后第30、110天(d30，d110)研究F1和F2后代的骨骼異常。對椎骨的研究數據顯示F1雌性橫突間寬度增加，椎骨變短，生長板厚度特別是肥大區厚度減少，而對F1雄性及所有F2個體無明顯影響，這種效應在雌性F1大鼠出生30 d達到最大并于110 d消失。

間充質干細胞具有多種分化潛能，可以分化為脂肪、骨及肌肉組織，BPA促進間充質干細胞脂肪分化，抑制骨分化[1]。但近期在人間質干細胞分化研究中的結果則表明：非毒性低濃度(1和10 nmol/L)的BPA會刺激成骨，但沒有明顯的劑量-效應關系，且僅出現于間質干細胞分化前預處理的情況下[7]。

1.2 骨密度。

盡管在前述實驗條件下觀察BPA對骨密度無明顯影響[3,5]，更多研究證實BPA暴露可降低骨密度。Zhang等[8]給4 周齡雌性 F344 大鼠灌胃給藥50、200、400 mg /(kg.d)，13周后測定椎體及股骨骨密度，結果顯示200 mg BPA/(kg BW.d)組椎體骨密度最低，50 mg BPA/(kg BW.d)組股骨骨密度最低，提示BPA降低骨密度，而苯甲酸雌二醇EB增加椎體骨密度增高，證實雌激素可減少骨流失。

如前所述BPA刺激間質干細胞脂肪分化而抑制其骨分化，而有學者在絕經前女性群體中證實BPA增加脂肪，但并未出現明顯的骨密度改變，說明BPA對骨密度的影響可能與脂肪代謝無關[9]。

盡管由于暴露劑量及實驗對象的種屬差異等因素，研究結論不甚一致，但基本的共識是環境劑量暴露BPA 負向影響成骨分化和骨密度，引起骨質減少、微結構惡化、增加骨脆性，誘發骨質疏松癥。不同時期BPA暴露會產生不同的效應，生命早期暴露于EDCs可產生不可逆的損害，并造成一些成人時期疾病。相反，成人接觸EDCs的影響往往是可逆的，但鑒于BPA存在的廣泛性和強脂溶性，其對于成年個體骨質的損害也不容忽視。

2 雙酚A影響骨代謝的作用機制

2.1BPA的抗雌激素效應及雌激素效應

BPA與雌激素(estrogen，E2)沒有結構同源性，但通常作為異雌激素并選擇性調節ERs。研究表明，雖然BPA對ERs的親和力較低，但它的影響強于E2，尤其是對非經典途徑的作用，如G蛋白偶聯受體(GPER)和雌激素相關受體(ERR)。BPA通常表現出雌激素拮抗效應，少數情況會顯示雌激素效應，取決于ER亞型和所涉及的組織[2]。

E2有維持骨骼的功能，如抑制促破骨細胞形成配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)表達，抑制白細胞介素(IL-1、6和11)、前列腺素(PGE-2)、TNF-α、TGF-β和胰島素樣生長因子(IGF)系統，通過減弱破骨細胞活性或直接調節破骨細胞功能來減少骨吸收。E2促進成骨細胞的增殖和分化，并維持鈣穩態，保證血漿鈣水平。BPA通過結合雌激素相關受體-γ(ERγ)產生雌激素拮抗作用，增加RANKL的表達，提高破骨細胞的活性，抑制成骨細胞分化，降低血漿鈣水平[10]。

區別于ERγ，BPA結合ERα造成雌激素效應，如BPA改變蛋白激酶C的亞型，加速哺乳動物軟骨的老化和骨骺閉合。Auxietre等[6]研究BPA對椎骨橫突的形態改變，發現孕哺乳期染毒使雌性個體到椎體生長板特別是肥大區的縮小，這種效應在出生后30 d達到最大，提示骨骼的早熟，該現象為雌激素效應。研究者通過加入雌激素受體的抑制劑和激動劑，證實了上述改變為BPA的雌激素效應導致。

2.2BPA對雄激素受體(AR)的作用

雄激素受體在骨發育和骨轉換中發揮著重要的作用，能增加培養中骨細胞的ALP陽性細胞的數量和陽性強度，促進骨細胞分化。在對大鼠的研究中，雌激素對雌性骨骼發育的作用更加明顯，使股骨更短更薄。而BPA對雄性骨骼的影響更顯著，這表明BPA暴露的影響可能不僅僅是雌激素受體相關效應[5]。有基因測定報告證明，BPA是AR拮抗劑，通過多種機制作用于雄激素受體。

2.3BPA調控凋亡相關因子

在各種病理及生理狀態下凋亡參與調控骨組織的發育、生長和穩態。前期研究證實BPA調控凋亡相關通路，促進凋亡。BPA調控Bcl-2家族Bad元件，從而影響凋亡效應因子Caspase8、9和3的激活。同時，BPA影響調控凋亡的NFATc1、MAPK、ERK和AKT等重要信號通路。體內體外研究均證實BPA還通過誘導氧化應激來刺激凋亡，總尿BPA水平與氧化應激水平呈高度正相關[2,10-11]。

2.4BPA參與DNA表觀修飾

位于細胞核的雌、雄激素受體分別與相應激素結合后激活，配體-受體復合物進入細胞核，作為轉錄因子結合DNA特定基因，調節基因表達，這種效應不會遺傳給子代。早期研究認為，BPA孕哺期染毒對軟骨內成骨的影響不能夠遺傳，然而Jacques等[12]的研究中，BPA使雄性大鼠足趾比例雌性化可以遺傳給子代，猜測與DNA表觀修飾有關。表觀遺傳機制包括DNA甲基化、組蛋白修飾(乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等)以及microRNAs在內的非編碼RNA的表達。BPA暴露可以誘導持久的表觀遺傳破壞，BPA很可能通過CpG位點的甲基化作用影響表觀遺傳機制，并誘導了組蛋白修飾，改變了染色質結構和轉錄活性。雙酚A促進小鼠乳腺中組蛋白甲基轉移酶EZH2(Enhancer of Zeste Homolog 2)蛋白的翻譯，通常會增加H3K27me3而導致基因抑制[13]。

然而表觀遺傳不表現在對股骨長度的影響上。近期Xin等[14]研究了BPA對骨的作用有無母系傳代效應，綜合Auxietre等[6]對父系傳代效應的研究，BPA造成的影響在實驗條件下不能證明影響F2股骨形態和強度。

2.5BPA參與Wnt /β-catenin信號對骨代謝的調控

Wnt/β-catenin信號是調節胚胎發育的經典通路，BPA通過調控Wnt/β-catenin信號通路影響干細胞增殖分化的學說被廣泛認同。在骨分化的調控中，BPA抑制Wnt/β-catenin信號通路從而干擾骨骼代謝。一項應用斑馬魚的研究表明BPA暴露上調凋亡是由于Wnt3a 誘導的促凋亡改變。Wnt /β-catenin信號既受到活性氧簇的調節(即受氧化應激條件的干擾)，又參與由ROS改變細胞存活程序造成的細胞死亡；Wnt/β-catenin能抑制RANKL的表達和上調成骨細胞分泌的骨保護素(osteoprotegrin，OPG)的表達，OPG能結合RANKL而抑制破骨細胞的活化[10,15]。可見BPA干擾骨骼的多種信號通路之間、成骨細胞和破骨細胞之間相互聯系與制約。

3 小結

BPA復雜的分子使其影響具有雙重性，例如BPA一方面提高破骨細胞的活性，另一方面通過凋亡相關蛋白和氧化應激途徑引起成骨細胞和破骨細胞凋亡。因此，BPA對不同物種、相同物種不同發育階段的影響差異很大。不同品系、劑量、染毒方式干擾對實驗結果的分析，以往實驗結論停留在與上述因素相關，具體影響的方式還需更加系統的實驗。目前BPA對骨骼機制的研究多為推測，尚不能確定。因此，為了解BPA對人類骨骼發育的干擾和損傷效果，有必要進行關于BPA對特定組織特定發育階段的作用機制的研究。