辛伐他汀延緩生酮飲食導致的骨量丟失的實驗觀察

楊舟 劉祺 許曉林 劉雅普 吳秀華 黃志平 黃祖成 孔剛剛 丁建羊 朱青安

南方醫科大學南方醫院脊柱骨科，廣東 廣州 510515

生酮飲食(ketogenic diet，KD)是一種高脂肪、低碳水化合物的配方飲食，可將機體從糖代謝轉變為脂肪氧化供能，增加酮體代謝，目前在臨床上是治療兒童耐藥性癲癇的手段之一[1]，也對急性和退變性神經系統疾病和急性脊髓損傷等具有治療作用[2]。然而，Hahn等[3]于1979年首次報道生酮飲食相關性骨量丟失，也有研究發現兒童難治性癲癇的患者在長期使用生酮飲食干預后發生骨量丟失[4]。本課題組前期研究證實了生酮飲食導致小鼠骨量丟失、力學性能下降[5]。因此由于生酮飲食在臨床上的應用而導致骨量丟失的不良反應不容忽視。

他汀類藥物是3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A 還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A，HMG-CoA) 的抑制劑，通過抑制膽固醇合成鏈中的限速酶HMG-CoA還原酶來減少膽固醇的合成。1999 年 Mundy 等[6]首次發現，他汀類藥物有激活成骨細胞、促進骨合成代謝的作用。隨后研究進一步發現，辛伐他汀能在體內和體外環境下通過提升骨形態發生蛋白2和堿性磷酸酶的表達水平刺激骨形成，還可以刺激骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化[7-8]，可能成為新的有效的治療骨質疏松癥的藥物。然而辛伐他汀對于生酮飲食引起的骨質疏松癥的治療未見報道。

本研究目的是通過分析股骨遠端松質骨和中段皮質骨的骨微結構、生物力學性能以及骨形態的改善等評價辛伐他汀對生酮飲食引起的骨質疏松癥的治療作用。

1 材料和方法

1.1 動物模型與分組

40只雌性8周齡C57BL/6 J小鼠，購自南方醫科大學實驗動物中心，平均體重為16～18 g。適應性喂養1周后隨機分為5組，分別為對照組(Sham)、卵巢切除組(OVX組)、卵巢切除加辛伐汀干預組(OVX+ST組)、生酮飲食組(KD組)、生酮飲食加辛伐他汀干預組(KD+ST組)。OVX和OVX+ST組小鼠在異氟烷麻醉下行雙側卵巢切除術，方法參照以往研究[9]。KD及KD+ST組小鼠予以碳水化合物與脂肪比為1∶3的生酮飲食(Zeneca，深圳，廣東，中國)喂養，而Sham組、OVX組、OVX+ST組喂以普通飲食(購自南方醫科大學實驗動物中心) (兩種飲食基本營養素含量見表1)。辛伐他汀治療組小鼠予以辛伐他汀20 mg/(kg·d)灌胃，方法參照以往研究[10]。12周取材，獲取血清及雙側股骨，左側股骨置于-80 ℃保存備用，右側股骨置于4%多聚甲醛中浸泡固定24 h備用。

表1 普通飼料與生酮飲食成分Table 1 Basic nutrient content in SD and KD

1.2 體重、血酮、血糖和子宮重量的測量

干預12周后，用CS 200電子稱(Ohaus Pine Brook NJ 美國)稱量小鼠體重。采用剪尾法獲取小鼠血液標本，并用血糖儀(JPS-5 怡成 北京 中國)、血酮儀(Meter T-1 Sentest Inc. 臺灣 中國)測量血糖和血酮。過量麻醉處死小鼠，仔細分離子宮后，于4 ℃冰箱生理鹽水中浸泡備用，紗布吸干生理鹽水后稱重。

1.3 顯微CT掃描

對所有小鼠的右側股骨行顯微CT(μ80 Scanco公司瑞士)掃描。預掃完畢后分別選擇股骨遠端1/3的部位和股骨中段180層作為掃描區域。掃描參數為電壓55 kV，電流145μA，層厚為12 μm。掃描結束后，以股骨髁消失作為第一層選取100層分析松質骨顯微結構，測量總礦物質密度(TMD)、骨體積分數(BV/TV)、骨小梁數目(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁連接密度(Conn.D)等。測量股骨中段的100層皮質骨的厚度(Ct.Th)、皮質骨總面積(Tarea)、皮質骨橫截面面積(Barea)。

1.4 股骨遠端松質骨壓縮試驗

通過有限元模型分析軟件(SCANCO Medical AG，版本1.13)，采用高分辨率骨微結構的三維圖像建立股骨遠端松質骨壓縮的有限元模型，在線彈性范圍內進行軸向壓縮仿真試驗，按同質和各向同性的彈性材料來模擬。其中骨材料的參數分別為泊松比ν=0.3，楊氏模量E=10 000 MPa，方法參照以往研究[11]。采用“Z軸方向高摩擦壓縮試驗”模擬股骨壓縮試驗，計算股骨遠端松質骨壓縮剛度。

1.5 股骨中段三點彎曲試驗

左側股骨標本在室溫下解凍1 h后，采用電磁伺服材料試驗機(E1000 Instron公司 美國)進行股骨三點彎曲試驗。具體方法如下：采用游標卡尺確定股骨的中點，將股骨放置于自制的三點彎曲平臺上，支架的跨距為10 mm，兩端支架到股骨中點的距離為5 mm，以2 mm/min的速度在股骨中點向下橫向施壓至破壞(圖1)。連續記錄載荷和位移，從載荷-位移曲線中得到最大載荷、最大位移、剛度、最大能量吸收。

圖1 股骨三點彎曲試驗Fig.1 Three-point bending test for the femurs

1.6 股骨骨組織學分析

顯微CT掃描后，右側股骨置于10%EDTA脫鈣4周后，自來水流水沖洗過夜，梯度乙醇脫水，石蠟包埋。每組標本行矢狀面切片，厚度約5 μm，HE染色，在光學顯微鏡選40倍鏡下觀察骨小梁結構。

1.7 統計學處理

所得數據用均數±標準差表示。采用單因素方差分析評價體重、子宮重量、血糖、血酮、血鈣、血磷、骨結構參數和力學參數。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 體重、子宮重量、血液指標

干預12周后各組間小鼠體重差異沒有統計學意義。OVX組和OVX+ST組小鼠子宮重量分別為(0.04±0.01)g 和(0.03±0.01)g，明顯低于Sham組(0.13±0.02)g，差異具有統計學意義(P<0.05)(表2)。

組別體重/(g)子宮重量/(g)Sham20.3±0.760.13±0.02OVX21.8±1.160.04±0.01?OVX+ST20.3±1.280.03±0.01?KD20.8±1.670.13±0.03KD+ST20.4±1.340.13±0.03

注：與Sham組相比，*P<0.05。

12周時KD組和KD+ST組血酮分別為(1.28±0.36)mmol/L和(1.48±0.53)mmol/L，均顯著高于Sham組(0.60±0.32)mmol/L。而各組之間的血糖、血清鈣或磷含量差異均沒有統計學意義(表3)。

組別血酮/(mmol/L)血糖/(mmol/L)血鈣/(mol/L)血磷/(mol/L)Sham0.60±0.327.25±1.032.20±0.102.36±0.28OVX0.75±0.177.33±0.992.17±0.132.29±0.26OVX+ST0.63±0.106.33±0.312.21±0.092.30±0.48KD1.28±0.36?7.83±0.812.14±0.032.38±0.52KD+ST1.48±0.53?6.25±0.682.12±0.132.10±0.36

注：與Sham組相比，*P<0.05。

2.2 股骨骨微結構

OVX組和KD組小鼠股骨遠端松質骨的總礦物質密度(TMD)分別為(36.3±8.84)mg/cm3和(39.2±13.5) mg/cm3，明顯低于Sham組(69.0±11.2) mg/cm3(P<0.05)。辛伐他汀治療后，OVX+ST組TMD為(53.0±10.1) mg/cm3，較OVX組顯著升高(P<0.05)。KD+ST組TMD為(51.8±6.20) mg/cm3，較KD組有所升高，但組間差異沒有統計學意義(P>0.05)。骨小梁連接密度(Conn.D)的組間變化與TMD組間變化趨勢相似。OVX+ST組股骨骨體積分數(BV/TV)顯著高于對照組(4%與6%)，同樣KD+ST組股骨骨體積分數也顯著高于對照組(4%與7%)。各組間骨小梁數目的變化趨勢與各組間的骨體積分數變化趨勢相同，而各組間骨小梁分離度的變化趨勢則相反(圖2)。

圖2 遠端股骨骨松質Micro-CT掃描注：與Sham組相比，*P<0.05；兩組間比較，#P<0.05。Fig.2 Micro-CT images and parameters of cancellous bone at the distal femurs

各組之間股骨中段皮質骨骨面積(Barea)或骨皮質厚度(Ct.Th)的差異沒有統計學意義(P>0.05)。OVX+ST組股骨中段皮質骨總面積(Tarea) 為(1.77±0.10)mm2，明顯高于OVX組(1.44±0.33)mm2(P<0.05)(圖3)。

圖3 中段股骨骨皮質Micro-CT掃描注：與Sham組相比，*P<0.05；兩組間比較，#P<0.05。Fig.3 Micro-CT images and parameters of cortical bone at the middle femurs

2.3 股骨遠端松質骨壓縮試驗

Sham組、OVX組、OVX+ST組、KD組和KD+ST組小鼠股骨遠端松質骨剛度分別為(320±146) N/mm、(47±41)N/mm、(233±74)N/mm、(35±15)N/mm和(161±38)N/mm。OVX組和KD組與Sham組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。OVX+ST組剛度大于OVX組，且組間差異有統計學意義(P<0.05)。盡管KD+ST組剛度高于KD組，但組間剛度的差異沒有統計學意義(圖4)。

圖4 有限元分析股骨遠端松質骨壓縮剛度注：與Sham組相比，*P<0.05；兩組間比較，#P<0.05。Fig.4 The stiffness results of finite element analysis at the distal femurs

2.4 股骨中段三點彎曲試驗

圖5 股骨三點彎曲實驗的力學參數注：與Sham組相比，*P<0.05；兩組間比較，#P<0.05。Fig.5 Mechanical parameters of the three-point bending test for the femurs

Sham組、OVX組、OVX+ST組、KD組和KD+ST組小鼠股骨最大載荷分別為(12.4±1.4)N、(11.1±0.7)N、(17.1±0.8)N、(12.5±1.1)N、(19.4±3.0)N。OVX+ST組和KD+ST組與Sham組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，辛伐他汀治療組顯著高于對照組(P<0.05)。股骨最大位移、能量吸收、剛度三個指標OVX+ST組比OVX組、KD+ST組比KD組、OVX+ST組和KD+ST組都比Sham組有所升高，但是組間差異沒有統計學意義(P>0.05)，而其中股骨最大能量吸收KD+ST組(2.46±0.73)mJ顯著高于Sham組(1.33±0.37)mJ和KD組(1.00±0.17)mJ(P<0.05)(圖5)。

2.5 股骨骨組織學分析

Sham組股骨遠端骨骺板下見到的骨小梁結構排列緊密、有規則，小梁間連接成網狀，骨小梁厚度較為一致。而OVX組和KD組骨小梁排列稀疏，總量明顯減少，骨小梁間連接性差，出現大量骨小梁盲端。辛伐他汀治療后骨小梁結構、骨小梁壁厚度、形態均較OVX組和KD組明顯改善，結構比較成熟，接近對照組(圖6)。

圖6 股骨遠端HE染色結果Fig.6 Histological images of the distal femurs with HE staining

3 討論

本研究不僅觀察辛伐他汀對KD骨量丟失的作用，同時也觀察辛伐他汀對OVX骨量丟失的影響，較全面地評價辛伐他汀對KD骨量丟失的效應。本文還從顯微CT和組織學兩個方面觀察了骨微結構的改變，分別采用有限元模型和三點彎曲試驗評價了股骨遠端松質骨和中段皮質骨的力學性能，從宏觀和微觀、結構和功能等多個層面來評價辛伐他汀緩解骨量丟失的作用。本文的結果表明在辛伐他汀干預后，由OVX和KD引起的股骨遠端松質骨骨量減少得到了改善，股骨中段皮質骨也得到增加，股骨三點彎曲實驗力學性能得到提升，說明辛伐他汀能夠改善由卵巢切除和生酮飲食導致的骨質疏松癥。

生酮飲食是一種以低碳水化合物而高脂為特點的飲食，用于治療難治性癲癇已有近百年的歷史，且它對心血管疾病的預防、神經損傷的保護甚至腫瘤的治療也被越來越多的報道[12]。盡管KD被認為是相對安全的治療方式，但是引起的不良反應卻不容忽視，尤其在治療小兒難治性癲癇時對骨的生長發育和代謝的影響[4]。我們前期研究發現了生酮飲食能誘導不同程度的骨量丟失、力學性能下降[5]，包括松質骨骨容量減少、間隔增寬、連接密度變低、骨小梁數下降、皮質骨厚度及剛度減弱等眾多方面。本研究結果顯示KD組較Sham組股骨遠端松質骨的TMD、Conn.D、BV/TV、Tb.N降低而Tb.Sp增加，再一次驗證了KD會引起小鼠骨量的丟失。

血鈣、血磷與骨組織中的鈣、磷保持動態平衡，血鈣、血磷水平的測定能反映出骨組織的代謝情況。血鈣和血磷在骨骼生長中具有重要的作用，血鈣水平下降會導致破骨細胞活性的增加，引起骨骼中的鈣被溶解，從腎臟流失，而血磷水平升高會引發骨吸收加速，最終導致骨質疏松癥[13]。本研究中各組之間的血清鈣或磷含量差異均沒有統計學意義，故OVX和KD引起的骨骼系統的變化不是由于鈣元素缺乏或血磷過高所引起。本研究股骨中段皮質骨KD組變化不大，與前期研究皮質骨厚度降低不一致，而其可能原因是兩次研究所用的生酮飲食的配方不同，舊配方中鈣元素含量偏低，而本研究用的生酮飲食中營養素含量符合美國營養學會(AIN93)大小鼠純化型標準飼料標準，保證了鈣、磷、維生素D的充足供應。

臨床上治療骨質疏松癥主要包括防止骨質吸收和促進骨形成兩種機制的藥物，前者有激素替代療法、選擇性雌激素受體調節劑、雙膦酸鹽類，包括選擇性雄激素受體調節劑、甲狀旁腺素類似物、催產素類似物等[14]。然而對于已經出現骨量丟失或是骨質疏松的患者，促進骨形成的藥物急需開發。辛伐他汀是3-羥基3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑家族成員之一，通過抑制膽固醇合成鏈中的限速酶HMG-CoA還原酶，減少膽固醇合成，臨床上主要用于治療高脂血癥[15]。Mundy 等[6]首次發現，他汀類藥物有激活成骨細胞、促進骨合成代謝的作用，大量研究已經報道辛伐他汀可能通過促進成骨細胞分化影響骨的形成[16-17]，可干擾破骨細胞、前體細胞向多核破骨細胞的融和過程[18-19]等機制對骨質疏松有延緩改善的作用。本研究發現KD+ST組較KD組TMD、Conn.D、BV/TV、Tb.N有所增加而Tb.Sp下降，最大載荷、最大位移、能量吸收、剛度增高，辛伐他汀緩解了由生酮飲食導致的骨量丟失。除此之外，OVX+ST組和OVX組相比在上述指標的變化趨勢相似，辛伐他汀同樣緩解由卵巢切除導致的骨量丟失，結論與其他學者實驗結論一致。

本研究發現了辛伐他汀對生酮飲食導致的骨量丟失的緩解作用，但是并沒有研究不同劑量及不同時間點對生酮飲食所引起的骨質疏松的影響。其次，本研究僅觀察到了辛伐他汀改善骨質疏松的現象，并沒有涉及其作用的機制。

總而言之，生酮飲食能夠誘導松質骨骨量丟失、生物力學性能下降，而辛伐他汀對于生酮飲食導致的骨量丟失和生物力學性能下降具有一定的緩解作用。