GNAS新錯義突變導致D/E型短指畸形

郭芮吉 韓剛 方霞 孫濱 崔恒慶 周晟博 孫文海 王斌

短指（Brachydactyly，BD）是一種以指體縮短為特征的先天畸形，患者的指骨、掌骨或兩者同時發育異常[1-2]。短指通常始于胚芽發生時（胚胎第8周）[3]，可獨立發生，也可作為綜合征的表型之一，如波蘭綜合征、Adamse-Oliver綜合征，并可伴發并指、多指等手部先天畸形[4－8]。該畸形診斷以體格檢查、影像檢查為主，X片即可顯示其骨骼解剖特點。分離型短指尚無有效的產前診斷方法。發育早期，胎兒超聲無法明顯觀察短指畸形。妊娠11周時絨毛膜絨毛取樣或14周時羊膜穿刺可鑒定胎兒是否攜帶致病基因[1]。因此，研究短指的致病基因對其診斷和治療十分必要。

1 資料與方法

1.1 患者資料

該短指畸形家系中短指畸形患者有3人 （圖1）。先證者右手Ⅲ1拇指、中指短小，X線示拇指末節、第3掌骨短小。Ⅲ2右手拇示中環小指短小，X線示五指掌骨均短小。Ⅱ1雙手拇指短小明顯，X片示拇指末節短小。遺傳方式是常染色體顯性遺傳。患者間表現度存在差異。先證者臨床化驗結果可知，堿性磷酸酶 51 U/L （正常 35～105 U/L），血鈣 2.27 nmol/L （正常2.15～2.50 nmol/L），甲狀旁腺素5.14 pmol/L（正常 1.60～6.90 pmol/L）。本研究經我院倫理委員會批準（編號：SH9H-2018-T50-2），患者及親屬均已簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

抽取Ⅲ1、Ⅲ2及Ⅱ1等3位患者和正常成員Ⅱ2的靜脈血，按標準操作流程，采用Dneasy blood and tissue kit（Qiagen No.69506）對全血樣本進行 DNA的抽提及純化，并用NanoDrop 2000c分光光度計測定DNA濃度。抽提DNA于-80℃下保存。

1.2.2 全外顯子測序

本研究對Ⅱ1、Ⅱ2、Ⅲ1、Ⅲ2的基因組進行了全外顯子測序。Agilent外顯子捕獲測序文庫構建流程處理基因組DNA。使用QubitR2.0 Fluorometer檢測所建文庫濃度，Agilent 2100檢測文庫大小。按照cBot User Guide指示，在測序儀（Illumina HiSeq X）配套的cBot上完成 Cluster生成、第一向測序引物雜交。按照HiSeq X User Guide準備試劑測序，將攜有cluster的flow cell上機。選用pair-end程序，進行paired end 2×150 nt multiplex測序。測序過程由data collection software（Illumina）進行控制。

1.2.3 數據分析

將測序下機數據轉化為Fastq文件格式，并進行質量評估。采用BWA(0.7.12)軟件進行序列比對，基因組比對的參考基因組版本為hg19，統計捕獲效率。采用GATK （version 3.5）分析工具Haplotype-Caller進行單核苷酸變異和插入缺失檢測，并用ANNOVAR軟件注釋變異結果。

1.2.4 Sanger測序

反應體系 20 μL（Toyobo）：KODfx buffer 10 μL，dNTPs 4 μL，primer 0.6 μL，DNA 4 μL，KODfx 0.4 μL，H2O 0.4 μL。反應條件：94 ℃ 2 min，1個循環，94 ℃10 sec，60 ℃ 30 sec，68 ℃ 1 min，共 35 個循環。 引物序列：F-GTTTCTGGTGAGTCGAGCCT，R-GGCCTCCCAACTTTTGACCTA。

圖1 先天性短指家系圖及其臨床表現Fig.1 Pedigree of a family with brachydactyly and its clinical features

2 結果

全外顯子測序顯示，所有樣本比對到參考基因組的比例約為80%，覆蓋度在99%以上，測序深度在80X以上。Ⅲ1檢測到單核苷酸變異84 029個，插入缺失16 080個。Ⅲ2檢測到單核苷酸變異84 587個，插入缺失16 185個。Ⅱ1檢測到單核苷酸變異83 602個，插入缺失16 236個。Ⅱ2檢測到單核苷酸變異84 768個，插入缺失17 061個。通過外顯子區域和非同義變異篩選，數據庫過濾、疾病模式篩選，發現該家系3名患者（Ⅲ1、Ⅲ2、Ⅱ1）在GNAS基因外顯子上均存在1個雜合錯義突變（NM_001077488:exon13:c.A1145T），導致其編碼蛋白中原先的天冬氨酸被替換為纈氨酸（p.D382V）（圖2）。該點突變尚未在ExAC[9-10]、Kaviar[11]數據庫報道。突變致病性預測軟件一致預測此突變為致病突變。通過PCR擴增、一代測序驗證3名患者均攜帶該突變，同時先證者母親（Ⅱ2）不攜帶該突變，與全外顯子測序結果一致，進一步驗證了該基因突變的致病性。

圖2 GNAS基因Sanger測序結果Fig.2 Sanger sequencing results of GNAS gene

3 討論

短指是10種手畸形中的一類，按解剖改變可分為A～E五型[2]。其中，D型表現為拇指末節的縮短，E型表現為掌骨的縮短，而掌骨縮短常為部分綜合征的特征性表現，部分E型短指患者可伴有輕度身材矮小、圓臉等表現[12]。若短指明顯影響外觀或功能時，可采取分指術、骨延長[13]、足趾移植術[14]等方法治療，但效果并不理想。由于缺乏對發病機制的認識，也很難對疾病進行早期干預。

本研究通過全外顯子和一代測序，在短指家系中發現了一個新的GNAS雜合錯義突變位點（NM_001077488:exon13:c.A1145T）， 其編碼蛋白中原先的天冬氨酸被替換為纈氨酸（p.D382V）。在人類先天性肢體畸形中，常可檢測到GNAS突變[15-16]。GNAS基因位于第20號染色體q13.3上，包含13個外顯子，編碼刺激性G蛋白的α亞單位（alpha-subunit of the stimulatory G protein，Gsα）和剪接變體[17]。1997年，Sunahara等[18]報道了 Gsα的晶體結構，發現Gsα由R as結構域和α螺旋結構域兩個亞結構組成[19]。1998 年，Dumas等[20]發現 Gsα 與其下游腺苷酸環化酶的相互作用。甲狀旁腺激素（PTH）通過其G蛋白偶聯受體甲狀旁腺激素/甲狀旁腺激素相關肽受體作用于幾種特定組織，在G蛋白偶聯受體接收到信號后，Ras結構域和α螺旋結構域間的GDP被釋放，結合GTP，并與刺激性G蛋白β亞基分離，進而和腺苷酸環化酶相互作用，促進cAMP產生，激活下游的蛋白激酶A催化亞基，通過活化的維生素D直接或間接調節血清鈣水平，影響生長發育[21-23]。

c.A1145T突變位于第13號外顯子上，而第12、13號外顯子編碼G蛋白偶連受體與之相互作用的區域[24]，原本親水性的天冬氨酸被替代為疏水性的纈氨酸，可能使G蛋白偶連受體與Gsα之間的相互作用發生異常，導致PTH作用于G蛋白偶連受體的信號無法正常傳導至Gsα，從而使Gsα無法與GTP結合，影響其下游腺苷酸環化酶的作用。GNAS基因突變后，其編碼的Gsα功能受損，造成單倍體劑量不足，影響成骨細胞和成骨前體細胞的信號傳導，可導致短指和/或異位骨化[25]。其突變和/或甲基化異常可導致假性甲狀旁腺功能減退癥（Pseudohypoparathyroidism，PHP）。 PHP可分為 PHP 1A 型、PHP 1B型、假性甲狀旁腺功能減退癥（PPHP）和進行性骨異位增生 （Progressive osseous heteroplasia，POH）4個亞型[21]。其中，PPHP的臨床表現為Albright遺傳性骨營養不良（Albright hereditary osteodystrophy，AHO），即身材矮小、圓臉、肥胖、短指等，但無甲狀旁腺激素（Parathyroid hormone，PTH）抵抗表現，通常呈顯性遺傳[21，26]。GNAS基因座前存在編碼反義轉錄本的NESP55基因，在腎小管、甲狀腺、垂體等組織中，存在母源性NESP55啟動子的甲基化，故NESP55基因無或僅有較少轉錄發生，而父源性NESP55啟動子在上述組織中無甲基化，故在NESP55基因轉錄發生后，父源性GNAS基因在正常個體的特定組織中被沉默[27]。當母源性GNAS基因發生突變時，可導致甲狀旁腺素抵抗和高磷血癥；當父源性GNAS發生突變時，則可導致PPHP，但不一定出現所有的AHO特征[17，28]。本研究中，先證者的GNAS基因突變為雜合型，且該突變遺傳自其父親。臨床化驗結果顯示，先證者血鈣、PTH均在正常范圍內，無PTH抵抗表現，故其表型屬于PPHP，符合GNAS基因印跡遺傳特點。該家系先證者Ⅲ1右手拇指末節、第3掌骨短小，Ⅲ2右手五指掌骨均短小，Ⅱ1雙手拇指末節短小，Ⅲ1、Ⅲ2屬于E型短指，Ⅱ1屬于D型短指，其表型存在一定變異度。目前尚無系統研究分析GNAS基因型和臨床表現型的關系，其規律有待進一步研究與探討。

本研究在短指家系中發現了1個新的GNAS雜合錯義突變位點，攜帶該突變基因可導致拇指末節、五指掌骨短小表現。這個突變位點的發現，擴展了GNAS基因的突變譜，豐富了攜帶GNAS突變的短指表型譜，為短指基因診斷、遺傳咨詢及治療提供了新的依據。