多管發(fā)酵法測定水質(zhì)糞大腸菌群的探討

黎堯 張紹斌

摘要：參照標(biāo)準(zhǔn)方法（HJ/T 347-2007）監(jiān)測糞大腸菌群項(xiàng)目過程中，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液滅菌后小倒管中氣泡難以盡除，培養(yǎng)液保存時(shí)間不長等現(xiàn)象，本文通過實(shí)驗(yàn)分析找出有效的解決方案，為提高監(jiān)測結(jié)果準(zhǔn)確性、保證樣品監(jiān)測時(shí)效性、更好地推廣應(yīng)用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)提供了參考。

關(guān)鍵詞：糞大腸菌群;多管發(fā)酵法;氣泡殘留;保存期

中圖分類號：X832? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：2095-672X（2019）05-0-01

DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2019.05.066

Abstract：In the process of monitoring the fecal coliforms project according to the standard method （HJ/T 347-2007），it was found that the bubbles in the small inverted tube were difficult to be removed after the culture solution was sterilized， and the preservation time of the culture solution was not long. Through experimental analysis to find effective solutions， in order to improve the accuracy of monitoring results， to ensure the timeliness of sample monitoring， to better promote the application of industry standards to provide reference.

Keywords：Fecal coliform;Multi-tube fermentation;Bubble residue; Shelf life

糞大腸菌群是反映水質(zhì)受糞便污染程度，是評定水環(huán)境質(zhì)量狀況的重要指標(biāo)之一[1]。目前90%以上的環(huán)境監(jiān)測機(jī)構(gòu)都采用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（HJ/T347—2007）中多管發(fā)酵法測定水質(zhì)糞大腸菌群[2]，然而在前處理過程中，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過高溫滅菌后，培養(yǎng)液中的小倒管仍有氣泡，同時(shí)滅菌后的培養(yǎng)液常規(guī)保存時(shí)間不長[3-4]。實(shí)驗(yàn)中常規(guī)消除氣泡干擾的方法是用針管向小倒管里注滿培養(yǎng)液后再倒扣放入試管中，這種方法雖然能消除氣泡，但是耗時(shí)。環(huán)境監(jiān)測任務(wù)具有時(shí)間、樣品量不確定性，且糞大腸菌群水樣采集后保存期短，因此需要常備滅菌倒管與培養(yǎng)液。但培養(yǎng)液保存時(shí)間不長，往往任務(wù)下達(dá)時(shí)才開始前處理，這樣就很難保證樣品分析的準(zhǔn)確性和時(shí)效性。

據(jù)此，本文就行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合工作實(shí)踐進(jìn)行研究，以期提高前處理效率和培養(yǎng)液保存時(shí)間，來保證樣品監(jiān)測結(jié)果的準(zhǔn)確性和時(shí)效性，為更好地推廣應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法（HJ/T347—2007）提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)環(huán)境、設(shè)備、試劑

生物實(shí)驗(yàn)室恒溫25℃，恒濕56%，實(shí)驗(yàn)室紫外滅菌。

中興電熱恒溫培養(yǎng)箱（DH-500型）：工作電壓AC220V、50Hz，溫度范圍室溫+5℃～65℃（為實(shí)際使用溫度）溫度波動(dòng)度：1℃，功率0.4KW;中興恒溫水浴鍋（DFD-700）溫控范圍：室溫+5℃～95℃溫度誤差：±1℃;海爾醫(yī)用冷藏箱（HYC-260）：箱內(nèi)溫度范2℃～8℃;雙哈全自動(dòng)立式電熱蒸汽消毒器（YM50）：儲物桶容積50L、溫度設(shè)定范圍室溫+5℃～126℃、時(shí)間設(shè)定范圍1～99min 、1～99h、補(bǔ)水水壓≥0.35MPa;上海良平電子天平（FA2004）;賽默飛世爾pH計(jì)（3STAR）;50ml試管，小倒管，有孔硅膠塞，無孔硅膠塞，試管架，滅菌牛皮紙。

單倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液：將10g蛋白胨，3g牛肉浸膏，5g乳糖，5g氯化鈉溶于1000ml蒸餾水中，調(diào)pH為7.2～7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml;三倍乳糖蛋白胨：將30g蛋白胨，9g牛肉浸膏，15g乳糖，15g氯化鈉溶于1000ml蒸餾水中，調(diào)pH為7.2—7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液3ml;EC培養(yǎng)液：將20g胰胨、乳糖5g、膽鹽三號5g、磷酸氫二鉀4g、磷酸二氫鉀1.5g、氯化鈉5g溶解于1000ml蒸餾水中。

1.2 實(shí)驗(yàn)原理

滅菌方法原理：在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸汽不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點(diǎn)不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在0.1MPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達(dá)115℃。在此蒸汽溫度下，殺滅各種微生物。

保存方法原理：在無菌狀態(tài)下，把經(jīng)過滅菌處理的培養(yǎng)液，裝進(jìn)事先滅菌或經(jīng)無菌處理的包裝容器內(nèi)，讓其儲存于不透風(fēng)、不透氣甚至不透光的特定環(huán)境中，在常溫下無需冷藏也能保持較長時(shí)期而成分不變。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 殘留氣泡實(shí)驗(yàn)操作步驟

將10mL單倍乳糖蛋白胨裝入50mL試管中，再將小倒管倒扣放入50mL試管中，分別用有孔、無孔硅膠塞塞緊試管，后將50mL試管放入試管架，并用牛皮紙包好乳膠塞并放入消毒器內(nèi)。設(shè)置溫度115℃，待溫度、達(dá)設(shè)定值后繼續(xù)滅菌時(shí)間20min。實(shí)驗(yàn)數(shù)量共8批次，每批次塞有無孔、有空硅膠塞的試管各100支，對應(yīng)消毒器內(nèi)溫度冷卻達(dá)到105℃、90℃、80℃、70℃、60℃、50℃、40℃、30℃、25℃時(shí)，取出試管觀察其產(chǎn)氣數(shù)量。三倍乳糖蛋白胨、EC培養(yǎng)液實(shí)驗(yàn)步驟同上。

1.3.2 培養(yǎng)液保存實(shí)驗(yàn)操作步驟

將10ml單倍乳糖蛋白胨裝入100支50mL試管中，每支試管10mL該培養(yǎng)液，再將小倒管倒扣放入50mL試管中，分別用有孔、無孔硅膠塞各50個(gè)塞緊試管，后放入試管架，并用牛皮紙包扎乳膠塞后放入消毒器內(nèi)。設(shè)置溫度115℃，待溫度、達(dá)設(shè)定值后繼續(xù)滅菌時(shí)間20min。將滅菌后的試管取出，并取下滅菌時(shí)包裹的牛皮紙，再包裝上紫外滅菌的干燥牛皮紙。實(shí)驗(yàn)數(shù)量每批次有空硅膠塞、無孔硅膠塞各50支，共4批次。分別于30d、60d、90d、120d按批次將裝有單倍乳糖蛋白胨的試管放入溫度設(shè)置為37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，取出觀察情況。三倍乳糖蛋白胨實(shí)驗(yàn)步驟同上;EC培養(yǎng)液滅菌、保存步驟、實(shí)驗(yàn)數(shù)量同上，按批次放入溫度設(shè)置為44.5℃的恒溫水浴鍋中培養(yǎng)24h。取出觀察情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 殘留氣泡去除實(shí)驗(yàn)

從表1可見，兩種條件下的樣品在滅菌鍋內(nèi)溫度下降到80℃及以上時(shí)開蓋，帶有氣泡的試管數(shù)量幾乎無變化;80℃～60℃開蓋，帶有氣泡的試管數(shù)量逐漸減少;60℃～40℃開蓋，帶有氣泡的試管數(shù)量明顯降低;40℃～25℃開蓋帶有氣泡的試管數(shù)量下降趨于穩(wěn)定;待滅菌鍋內(nèi)溫度冷卻至室溫時(shí)開蓋，氣泡去除率最高。兩相對比，塞有孔硅膠塞樣品的氣泡去除近100%，效果明顯優(yōu)于塞無孔硅膠塞樣品的氣泡去除效果。

2.2 培養(yǎng)液保存實(shí)驗(yàn)

從表2可見，塞有孔乳膠塞的樣品，60天保存期內(nèi)符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的分析要求。保存60～120天的樣品，隨保存時(shí)間增加，樣品干擾數(shù)量增加。最佳保存期是60天以內(nèi)。塞無孔硅膠塞的樣品，三倍乳糖蛋白胨保存至120天時(shí)，有2支不符合標(biāo)準(zhǔn)要求外，其余均能滿足標(biāo)準(zhǔn)要求。兩相對比，塞無孔硅膠塞樣品的保存時(shí)間明顯優(yōu)于塞有孔硅膠塞樣品。

3 結(jié)論

通過實(shí)驗(yàn)比對，選取有孔硅膠塞作為密封塞，滅菌時(shí)小倒管中氣泡的去除率近100%，培養(yǎng)液保存期達(dá)60天。有效消除了試管中氣泡殘留的干擾，最大限度地增加了培養(yǎng)液的保存期限。期望通過文本的研究，可以在方法（HJ/T 91-2002）的實(shí)際操作中能夠提高前處理效率，保證樣品分析的準(zhǔn)確性和時(shí)效性。

參考文獻(xiàn)

[1]GB3838-2002，地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[S].

[2]HJ/T 91-2002，地表水和污水監(jiān)測技術(shù)規(guī)范[S].

[3]黃彬漢.液體培養(yǎng)基保存方法[J].微生物學(xué)通報(bào)，1986， 13（3）：47-48.

[4]王開校.培養(yǎng)基保存方法的改善[J].中國醫(yī)藥指南，2014（19）：110-111.

收稿日期：2019-01-27

作者簡介：黎堯（1984-），男，漢族，本科學(xué)歷，工程師，研究方向?yàn)榄h(huán)境監(jiān)測。