豬圓環病毒2 型與3 型混合感染的PCR 檢測

蘇述色日

（四川省金陽縣動物衛生監督所 四川涼山 610025）

豬圓環病毒（porcine circovirus，PCV）為迄今發現的最小動物病毒，根據基因型不同可分為PCV-1、PCV-2 和PCV-3[1]。 其 中PCV-1 對豬無致病性。PCV-2 具有致病性，是當前危害豬群的主要免疫抑制性疫病之一。PCV-3 為近幾年新發現的病毒基因型，其致病性尚未明確，但在臨床中繁殖障礙母豬和急性死亡仔豬體內可檢測到PCV-3，推測PCV-3 可能引起與PCV-2 相似的臨床癥狀[2]。2018 年12 月，某豬場發生了一起以母豬繁殖障礙，仔豬呼吸困難、咳喘、消瘦、腹瀉、死亡，育肥豬漸進性消瘦為主要特征的疫病，經臨床診斷初步懷疑為PCV 感染，為對此次疫病進行確診，本文采集臨床病料樣品進行了PCR 檢測。

1 材料與方法

1.1 臨床病料樣品的采集與處理

無菌采集病死豬的淋巴結、脾臟、肝臟、腎臟等病變組織，將其溶解于5 倍體積生理鹽水中，經搗碎、碾磨、離心后，取上清液，-20℃保存備用。

1.2 主要試劑

病毒基因組DNA 提取試劑盒購自北京百泰克生物科技有限公司；Taq 酶、dNTP 均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 引物設計與合成

參照楊永寧等[3]建立的PCV-2 和PCV-3 雙重PCR鑒別檢測方法分別設計合成PCV-2 檢測引物（上游引物：5'-TGGCGGGAGGAGTAGTTT-3'； 下 游 引 物：5'-CCTCTCCCGCACCTT -3'） 和PCV-3 檢 測 引 物（ 上游 引 物：5'-AAAGAGGCCAGCGAGTA-3'； 下 游 引 物：5'-CACTCCTCCGGTACAACA-3'）。該 方 法 可 對PCV-2 和PCV-3 分別擴增出片段大小約為300bp 和518bp 的特異性片段。

1.4 病毒基因組DNA 的提取

利用病毒基因組DNA 提取試劑盒提取處理后臨床病料樣品的基因組DNA。

1.5 PCR 擴增

以提取的臨床病料樣品基因組DNA 為模板，參照楊永寧等[3]的PCR 擴增方法進行PCR 擴增。PCR 擴增反應體系為：DNA 5μL、10×Buffer 5μL、dNTP 4μL、PCV-2 上游引物1μL、PCV-2 下游引物1μL、PCV-3 上游引物1μL、PCV-3 下游引物1μL、Taq 酶1μL、水31μL。PCR 反 應 程 序 為：95 ℃ 5min；95℃ 40s，54℃ 40s，72℃ 40s，30 個循環；72℃ 10min；4℃終止反應。PCR 擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測分析。

2 結果與分析

如圖1 所示，臨床病料樣品經PCV-2 和PCV-3 雙重PCR 鑒別檢測方法可同時擴增出300bp和518bp左右的兩條特異性片段，片段大小分別與楊永寧等[3]報道的PCV-2 和PCV-3 目的條帶片段大小一致。表明臨床病料樣品經PCR 檢測PCV-2 和PCV-3 均為陽性，該臨床病例發生了PCV-2 和PCV-3 的混合感染。

3 討論

由于現有的PCV-2 商品化疫苗對PCV-3 的保護性較差或無保護性，故準確的鑒別診斷致病原是PCV-2 還是PCV-3，對因地制宜的制定PCV 的防控措施至關重要。楊永寧等[3]建立的PCV-2 和PCV-3 雙重PCR 鑒別檢測方法在同一個PCR 反應體系中同時加入針對PCV-2 和PCV-3 的特異性引物，根據PCR擴增產物片段大小的不同，實現兩種致病原的同時檢測，具有簡單、快速、準確、成本低等優點。鑒于此，本研究利用楊永寧等[3]建立的PCV-2 和PCV-3 雙重PCR 鑒別檢測方法對臨床病料樣品進行了PCR 檢測，表明臨床病例為PCV-2 和PCV-3 混合感染，說明PCV-3 不僅在豬群中廣泛流行，且其存在與PCV-2 的雙重感染現象，PCV-2 和PCV-3 的混合感染將大大增加PCV 的防控難度，造成的經濟損失也更加嚴重，應引起高度重視。