基于雙重猝滅分子信標及核酸染料Hoechst 33258對單鏈核酸的雙色定量檢測

魯子敬 熊威威 翟琨 向東山 譚志斗

摘?要?利用鳥嘌呤（G）堿基和有機猝滅基團Black Hole Quencher 1 （BHQ-1）對熒光基團6-羧基熒光素（6-Carboxyfluorescein group，FAM）的雙重猝滅作用構建了一種結構簡單的雙重猝滅分子信標，結合核酸染料Hoechst 33258，以艾滋病毒RNA片段的反轉錄序列（33個堿基）為目標DNA，建立了一種高靈敏單鏈核酸（ssDNA）的雙色熒光定量檢測方法。此分子信標中，熒光基團及有機猝滅基團分別設計為FAM和BHQ-1，分子信標的莖的堿基全部設計為C-G堿基對，環的堿基序列設計為目標DNA的互補序列，與BHQ-1相連接的為3個帶有G堿基的核苷酸。沒有目標DNA時，分子信標呈莖-環結構，熒光基團FAM與有機猝滅基團BHQ-1及G堿基距離很近，在BHQ-1及G堿基的雙重猝滅下，FAM的熒光很弱;另外，分子信標的莖的堿基全部是C-G堿基對，不能與核酸染料Hoechst 33258相結合，因此Hoechst 33258的熒光也很弱。當有目標DNA存在時，分子信標的環與目標DNA雜交形成雙鏈，莖-環結構被破壞，FAM遠離猝滅基團BHQ-1及G堿基，其熒光得到恢復; 同時，核酸染料Hoechst 33258與雙鏈DNA中的A-T堿基對相結合，其熒光顯著增強。根據熒光基團FAM及核酸染料Hoechst 33258熒光增強的程度可實現對ssDNA的定量檢測。在優化的條件下，目標DNA的濃度在0.05～8.0 nmol/L范圍內時，FAM和Hoechst 33258的總熒光強度（ΔIT）與目標DNA的濃度（C）具有良好的線性關系，回歸方程為ΔIT=192.2C + 115.08 （R2=0.9938），檢出限為20 pmol/L （3σ， n=9）。此方法操作簡單、靈敏度高、選擇性好、檢出限低。

關鍵詞?雙重猝滅分子信標; 單鏈核酸; Hoechst 33258; 雙色熒光; 定量檢測

1?引 言

單鏈核酸的檢測在分子生物學、遺傳學、分子醫學及食品科學等領域都具有十分重要的意義[1～5]。分子信標（Molecular beacons）是一種具有高選擇性的莖-環結構的寡核苷酸探針，廣泛用于核酸、蛋白質、藥物分子及金屬離子的分析與檢測，尤其是單鏈核酸的檢測中[6，7]。Hoechst 33258是一種高靈敏的染料，在水溶液或單鏈DNA溶液中熒光很弱，但與含A-T堿基對的雙鏈DNA具有很強的親和作用，且與雙鏈DNA結合后，熒光強度會顯著增加[8～11]。

傳統的分子信標在檢測DNA時，與某些熒光染料相比，其靈敏度相對較差[12，13];此外，傳統的分子信標中有機猝滅基團對熒光基團的猝滅效果不是很好，背景信號偏高，影響方法靈敏度[14，15]。

為降低傳統分子信標的背景熒光，許多研究者對分子信標的有機猝滅基團進行了改進，如Adegoke等[14]用納米金替代分子信標的有機猝滅基團，Oh等[15]利用氧化石墨烯替代分子信標中的猝滅基團。這些改進都極大地降低了分子信標的背景，但這類分子信標制備過程復雜，成本高。為提高分子信標檢測的靈敏度，本研究組在利用分子信標進行檢測時引入了熒光染料 [12，13，16]，顯著提高了檢測的靈敏度，但也導致了熒光背景增加， 如利用分子信標及熒光染料SYBR GreenⅠ建立了一種雙色熒光定量檢測DNA的方法[13]，引入熒光染料SYBR GreenⅠ，顯著提高了檢測的靈敏度，但熒光染料SYBR GreenⅠ能與分子信標莖的堿基發生作用，與雙鏈作用無選擇性，導致熒光背景信號增加[17]。

本研究利用鳥嘌呤（G）堿基和有機猝滅基團BHQ-1對熒光基團FAM的雙重猝滅作用，設計了一種分子信標，并結合核酸染料Hoechst 33258，建立了一種單鏈核酸的高靈敏雙色熒光定量檢測方法。在此方法中，引入的核酸染料Hoechst 33258可以和分子信標與目標DNA雜交后形成的雙鏈DNA作用，使熒光信號顯著增強，因此可顯著提高檢測的靈敏度。另外，本研究對分子信標進行了兩方面改進，一是利用G堿基和有機猝滅基團對熒光基團進行雙重猝滅，使分子信標本身的熒光背景信號顯著下降[18];二是分子信標的莖的堿基全部設計為C-G堿基對，核酸染料Hoechst 33258不能與之結合，因此引入的熒光染料幾乎沒有熒光背景信號，從而降低檢出限，顯著提高了檢測靈敏度。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

RF-5301PC型熒光光譜儀（日本Shimadzu公司）。

Hoechst 33258購于北京泛博生物化學有限公司;其它試劑均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。所用緩沖溶液為0.1 mol/L Tris-HCl 緩沖溶液;分子信標和所有的寡核苷酸序列均由上海生工生物技術有限公司合成，序列見表1。

2.2?樣品的制備

首先，將分子信標用 0.1 mol/L Tris-HCl 緩沖溶液（pH 8.0）配制成80 nmol/L儲備液，再將目標DNA配制成不同濃度的溶液。將50 μL不同濃度的目標DNA加入到50 μL 80 nmol/L分子信標溶液中，混合均勻，在50℃水浴中加熱5 min，冷卻至室溫后，加入Tris-HCl緩沖溶液至終體積為 450 μL，加入50 μL 2 μmol/L Hoechst 33258，在室溫下反應8 min，檢測體系的FAM及Hoechst 33258的熒光信號。在方法靈敏度的考察實驗中，首先將不同的目標DNA用0.1 mol/L Tris-HCl 緩沖溶液（pH 8.0）配制成60 nmol/L的儲備液，再分別取50 μL目標DNA及互補DNA混合均勻，室溫下反應5 min，加入50 μL 2 μmol/L Hoechst 33258，在室溫下反應8 min，檢測Hoechst 33258的熒光信號。

2.3?目標DNA的檢測

通過檢測反應后體系中FAM及Hoechst 33258的熒光信號實現目標DNA的檢測。對FAM熒光的檢測采用同步熒光分析法，同步掃描的波長間隔（Δλ）為26 nm，最大發射波長為526 nm。檢測Hoechst 33258的熒光信號時，最大激發波長為346 nm，最大發射波長為463 nm，激發及發射狹縫寬度均為10 nm。 檢測波長均為FAM及Hoechst 33258的最大發射波長。

2.4?方法選擇性考察

50 μL 80 nmol/L目標DNA序列和相同濃度的堿基錯配序列均按2.2節的方法進行配制，分別檢測體系中FAM及Hoechst 33258的熒光信號，最后對總的熒光強度進行比較和分析。

3?結果與討論

3.1?檢測原理

利用雙重猝滅分子信標及Hoechst 33258檢測DNA的原理如圖1所示。雙重猝滅分子信標的熒光基團設計為FAM，猝滅基團為BHQ-1，分子信標的莖由8對核苷酸組成，堿基組成全部為C-G堿基對，與BHQ-1相連接的為3個帶有G堿基的核苷酸，分子信標的環由33個核苷酸組成，其堿基序列為目標DNA的互補序列。沒有目標DNA時，分子信標呈莖-環結構，熒光基團FAM與有機猝滅基團BHQ-1及G堿基相互靠近，在BHQ-1及G堿基的雙重猝滅下，FAM的熒光信號很弱;此外，分子信標的莖的堿基全部設計為C-G堿基對，不能與核酸染料Hoechst 33258相結合，因此Hoechst 33258的熒光也很弱。當目標DNA存在時，分子信標與目標DNA雜交形成雙鏈DNA，莖-環結構被破壞，FAM遠離猝滅基團BHQ-1及G堿基，其熒光得到恢復;同時，核酸染料Hoechst 33258與雙鏈DNA中的A-T堿基對相結合，其熒光信號也顯著增強。根據熒光基團FAM及核酸染料Hoechst 33258熒光增強的程度即可實現對單鏈核酸的雙色定量檢測。

3.2?可行性分析

圖2為不同濃度的目標DNA與相同濃度的分子信標和Hoechst 33258作用后，FAM和Hoechst 33258所對應的熒光光譜圖。在沒有目標DNA存在時，FAM和Hoechst 33258的熒光信號都很弱（圖2A-a，圖2B-a）;目標DNA存在時，FAM和Hoechst 33258的熒光強度都顯著增加，且DNA濃度越高時，FAM和Hoechst 33258熒光增強程度越大（圖2A-b，c，圖2B-b，c）。另外，當目標DNA存在時，分子信標打開，此時其兩端的熒光基團FAM和猝滅基團BHQ-1距離嵌入雙鏈DNA的Hoechst 33258分子都很近。Hoechst 33258與FAM之間可能存在熒光共能量轉移，猝滅基團BHQ-1也可能對Hoechst 33258的熒光有一定的猝滅作用。從圖2B可見，采用346 nm激發光時，未觀察到FAM的熒光峰，說明在Hoechst 33258與FAM之間不存在熒光共振能量轉移;Hoechst 33258的最大發射波長（本實驗的檢測波長）為463 nm，而猝滅基團BHQ-1的猝滅范圍在480～580 nm之間，BHQ-1不會對Hoechst 33258檢測波長處的熒光有猝滅作用。因此，利用本方法對目標DNA的雙色定量檢測是可行的。

3.3?實驗條件的優化

3.3.1?Hoechst 33258濃度的選擇?核酸染料Hoechst 33258和與含A-T堿基對的雙鏈DNA結合后才會產生熒光，在分析體系中通常采用相對過量的Hoechst 33258，以保證可與所有雜交形成的雙鏈DNA結合，但濃度過大又會產生背景信號。實驗表明，在分子信標及目標DNA濃度均為8 nmol/L時，Hoechst 33258的濃度在0～100 nmol/L范圍內，其熒光強度隨濃度的增加而增大;當Hoechst 33258濃度超過100 nmol/L后，其熒光強度不再發生變化。為了保證分析體系中Hoechst 33258相對過量，本實驗選擇其濃度為200 nmol/L。

3.3.2?pH值對檢測的影響?緩沖體系的pH值不僅可以影響分子信標與目標DNA的雜交效果，還可能直接影響熒光染料的發光強度。在pH<8.0時，FAM與Hoechst 33258的總熒光強度隨著pH值的增大而增大，在pH=8.0時達到最大，說明目標DNA的檢測在略偏堿性的緩沖溶液中效果較好。因此選擇pH 8.0的Tris-HCl緩沖溶液。

3.3.3?Hoechst 33258與雙鏈DNA作用時間的影響?Hoechst 33258只有與雙鏈DNA中的A-T堿基對結合后才會發出較強的熒光。對Hoechst 33258與雙鏈DNA的結合時間進行了考察。結果表明，結合時間小于8 min時，Hoechst 33258的熒光強度隨著時間的延長而增加;當結合時間超過8 min后，Hoechst 33258的熒光強度幾乎不再發生變化，說明Hoechst 33258與雙鏈DNA的結合在8 min內已完成。因此， Hoechst 33258與雙鏈DNA的結合時間選擇為8 min。

3.3.4?目標DNA中A-T堿基的數量對方法靈敏度的影響?Hoechst 33258只與雙鏈DNA中的A-T堿基對作用，因此目標DNA中A-T堿基的數量直接影響染料Hoechst 33258的熒光強度，從而影響方法的靈敏度。本實驗所使用的分子信標環的堿基總數為33個，與目標DNA反應后形成的雙鏈DNA中共有33對堿基。因此設計了5種總堿基數均為33個，含A-T堿基的數量分別為0、7、14、21和28個的DNA（表1），對單鏈DNA中A-T堿基的數量與Hoechst 33258熒光強度的關系進行了考察。結果表明，單鏈DNA中A-T堿基的數量越多，Hoechst 33258的熒光強度越大，即目標DNA中A-T堿基的數量越多，方法的靈敏度也越高。

3.4?方法的分析性能

在優化的條件下，檢測不同濃度目標DNA存在下的FAM和 Hoechst 33258熒光強度（圖3及圖4）。結果表明，目標DNA的濃度在0.05～8.0 nmol/L范圍內，FAM和 Hoechst 33258的熒光強度（ΔI，ΔI=I-I0， I0表示沒有目標DNA的熒光強度，I表示有目標DNA的熒光強度）與目標DNA的濃度（C）均呈良好的線性關系（圖4A和4B），回歸方程分別為ΔI1=84.9+C + 6.83 （R2=0.9928）， ΔI2=109.9C + 69.11（R2=0.9981）。另外，FAM和 Hoechst 33258總的熒光強度（ΔIT， FAM在525 nm處的熒光強度與Hoechst 33258在463 nm處的熒光強度之和）與目標DNA的濃度（C）也具有良好的線性關系（圖4C），線性方程為ΔIT=192.2C + 115.08 （R2=0.9938），檢出限為20 pmol/L （3σ， n=9）。上述結果表明，利用FAM和 Hoechst 33258總的熒光強度對目標DNA進行檢測時，工作曲線的斜率均大于利用FAM或 Hoechst 33258單獨的熒光強度對目標DNA進行檢測時的斜率，靈敏度更高。對9個相同濃度的目標DNA（500 pmol/L）進行測定，其相對標準偏差（RSD）為 2.3%，精密度良好。與其它已報道的利用分子信標對單鏈DNA的檢測方法相比（表2），本方法的靈敏度更高，檢出限更低。

3.5?方法的選擇性

采用本方法檢測了濃度均為8 nmol/L的目標DNA、單堿基錯配的DNA、雙堿基錯配的DNA及三堿基錯配的DNA（圖5）。結果表明，單堿基錯配的DNA、雙堿基錯配的DNA及三堿基錯配的DNA所對應的熒光強度（ΔIT）都遠低于目標DNA所對應的熒光強度，表明本方法具有良好的選擇性。

3.6?實際樣品中目標DNA的檢測

將兩個相同濃度的目標 DNA分別用緩沖溶液和人血清稀釋至800 pmol/L，并分別用緩沖溶液和人血清做空白實驗，扣除空白值（背景熒光）后，兩者總的熒光強度（ΔIT，FAM與Hoechst 33258的熒光強度之和）基本一致，表明本方法具有良好的實用性，可用于復雜樣品的分析。

4?結 論

利用G堿基和有機猝滅基團BHQ-1對熒光基團FAM的雙重猝滅作用構建了一種結構簡單的雙重猝滅分子信標，結合核酸染料Hoechst 33258，建立了高靈敏的雙色熒光定量檢測單鏈核酸的方法。本方法降低了熒光背景信號，從而降低了方法的檢出限，顯著提高了檢測靈敏度。

References

1?Cui W， Liu J J， Su D H， Hu D Y， Hou S， Hu T N， Yang J Y， Luo Y P， Xi Q， Chu B F， Wang C L. Acta Bioch. Bioph. Sin.， 2016， 48（6）： 563-572

2?Niu X H， He W Y， Song B， Ou Z H， Fan D， Chen Y C， Fan Y， Sun X F. J. Biol. Chem.， 2016， 291（32）： 16576-16585

3?Li P P， Liu X P， Mao C J， Jin B K， Zhu J J. Anal. Chim. Acta， 2019， 1048： 42-49

4?Sani N D M， Heng L Y， Marugan R S P M， Rajab N F. Food Chem.， 2018， 269： 503-510

5?Loescher S， Groeer S， Walther A. Angew. Chem. Int. Edit.， 2018， 57（33）： 10436-10448

6?Qian C， Wang R， Wu C， Wang L， Ye Z， Wu J， Ji F. Anal. Chim. Acta， 2018， 1040： 105-111

7?Zhang Z， Xiang X， Huang F H， Zheng M M， Xia X Y， Han L. Sens. Actuators B， 2018， 273： 159-166

8?Amirbekyan K， Duchemin N， Benedetti E， Joseph R， Colon A， Markarian S A， Bethge L， Vonhoff S， Klussmann S， Cossy J， Vasseur J J， Arseniyadis S， Smietana M. ACS Catal.， 2016， 6（5）： 3096-3105

9?Xiang D S， Zhai K， Sang Q Z， Shi B A， Yang X H. Anal. Sci.， 2017， 33（3）： 275-279

10?Anuradha， Alam M S， Chaudhury N K. Chem. Pharm. Bull.， 2010， 58（11）： 1447-1454

11?Shahabadi N， Shiri F， Norouzibazaz M， Falah A. Nucleos. Nucleot. Nucl.， 2018， 37（3）： 125-146

12?XIANG Dong-Shan， ZHAI Kun， XIANG Wen-Jun， WANG Lian-Zhi. Chinese J. Anal. Chem.， 2014， 42（8）： 1210-1214

向東山， 翟 琨， 向文軍， 王聯芝. 分析化學， 2014， 42（8）： 1210-1214

13?Xiang D S， Zhou G H， Luo M， Ji X H， He Z K. Analyst， 2012， 137： 3787-3793

14?Adegoke O， Park E Y. Nanoscale Res. Lett.， 2016， 11（1）： 523-528

15?Oh H J， Kim J， Park H， Chung S， Hwang D W， Lee D S. Biosens. Bioelectron.， 2019， 126： 647-656

16?Xiang D S， Zhai K， Xiang W J， Wang L Z. Talanta， 2014， 129： 249-253

17?Hu H， Zhang J Y， Ding Y， Zhang X F， Xu K L， Hou X D， Wu P. Anal. Chem.， 2017， ?89（9）： 5101-5106

18?ZHAI Kun， LI Feng-Quan， SHI Bo-An， XIANG Dong-Shan. Chinese J. Anal. Chem.， 2017， 45（10）： 1462-1466

翟 琨， 李奉權， 史伯安， 向東山. 分析化學， 2017， 45（10）： 1462-1466

19?Hu J， Zheng P C， Jiang J H， Shen G L， Yu R Q， Liu G K. Analyst， 2010， 135： 1084-1089

20?Zhang P， Beck T， Tan W H. Angew. Chem. Int. Edit.， 2001， 40（2）， 402-405

21?Mao X， Xu H， Zeng Q， Zeng L， Liu G. Chem. Commun. 2009， 21： 3065-3067

22?Han D， Wei C Y. Talanta， 2018， 181： 24-31

23?Xiang D S， Zheng A H， Luo M， Ji X H， He Z K. Sci. China Chem.， 2013， 56（3）： 380-386