小檗堿對人肝癌SMMC-7721細胞bcl-2、bax表達的影響

任曉鳳 許亞軍

黃河三門峽醫院 河南科技大學附屬黃河醫院，河南省三門峽市 472000

肝癌發病率在國內居高不下。前人基礎研究多集中在藥物肝癌細胞SMMC-7721增殖和凋亡率的影響，但是未對凋亡相關蛋白做深入研究。近年來研究發現，小檗堿(Berberine，Ber)對數種腫瘤細胞有抑制作用，例如人肝癌細胞HepG2和人胃癌細胞BGC-803等[1-2]。本文擬研究Ber對肝癌SMMC-7721細胞的增殖及凋亡相關蛋白bcl-2和bax表達的影響，探討Ber的抗腫瘤應用，為臨床提供數據支持。

1 材料和方法

1.1 材料 人肝癌SMMC-7721細胞購自中國科學院細胞庫。RPMI-1640培養液購自Thermo Fisher Scientific公司。胎牛血清購自蘭州榮曄生物科技有限公司。Ber購自Sigma-Aldrich公司。CCK8購自武漢博士德生物工程有限公司。Bcl-2抗體、bax抗體和β-actin抗體購自Santa Cruz公司。

1.2 細胞培養與藥物干預 將人肝癌SMMC-7721細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液中，37℃、5%CO2、無菌、恒溫、恒濕培養，取3-4代的細胞用于實驗。藥物干預確定分組：對照組為RPMI-1640培養液培養；實驗組加入Ber使終濃度分別達到0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.5mmol/L。分別培養24h、48h和72h。

1.3 CCK8檢測細胞增殖抑制率 SMMC-7721細胞用0.25%胰酶消化后均勻接種在96孔板內，貼壁后加入Ber使終濃度達到0mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.5mmol/L，每種濃度設5個復孔，分別作24h、48h、72h后，每孔加入CCK8溶液10μl再無菌培養1.5h，490nm波長測量各孔吸光度值，計算各組增殖抑制率。

1.4 Western blot檢測bcl-2和bax蛋白的表達 選取對數期SMMC-7721細胞接種于6孔板，長滿80%后加入Ber使終濃度達到0mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.5mmol/L，繼續培養48h，RIPA裂解液裂解，BCA法蛋白定量，12%SDS-PAGE凝膠電泳，半干轉印后使用5%脫脂奶粉室溫封閉3h，加入小鼠源bcl-2抗體(1∶200)、bax抗體(1∶200)和β-actin抗體(1∶200)4℃孵育過夜，1×TBST洗膜3次，加入含HRP的抗小鼠二抗室溫孵育3h，再次用1×TBST洗膜3次，采用BIO-RAD化學發光成像系統曝光，Image Lab軟件分析條帶。

2 結果

2.1 Ber抑制SMMC-7721細胞生長 經Ber處理過的SMMC-7721細胞出現縮小、皺縮現象。實驗結果顯示，隨著Ber濃度的增加和作用時間的延長，細胞的生長被Ber逐漸抑制，有一定的濃度依賴性和時間依賴性，同時在0.2mmol/L濃度和48h時間點條件下，抑制率最高(見表1)。提示Ber可在體外抑制SMMC-7721細胞生長。增殖抑制率=(對照組OD-實驗組OD)/(對照組OD-空白組OD)×100%。

表1 Ber對SMMC-7721細胞增殖的影響

注：a指與Ber 0.1mmol/L組相比，P<0.05；b指與Ber 0.2mmol/L組相比，P<0.05；*指與24h相同濃度組相比，P<0.05；#指與48h相同濃度組相比，P<0.05。

2.2 Ber上調SMMC-7721細胞bax表達，下調bcl-2表達，促進凋亡 選取48h條件下Ber最適濃度0.2mmol/L干預SMMC-7721細胞，做Western blot發現，與對照組相比，實驗組bax蛋白表達明顯增高(P<0.001)，bcl-2蛋白表達明顯降低(P=0.026<0.05)，bax/bcl-2比值明顯增高(P<0.001)，差異均有統計學意義。說明Ber可以通過上調bax蛋白表達、bax/bcl-2比值和下調bcl-2蛋白表達，從而介導SMMC-7721細胞凋亡(見圖1)。

圖1小檗堿對SMMC-7721細胞bcl-2及bax蛋白表達的影響

注：a指與對照組相比，P<0.05。

3 討論

肝癌發病率高，病死率也高。目前藥物治療多管齊下，使患者生存時間延長。考慮到中草藥為我國獨有，尤其小檗堿源自黃連，為一種季銨生物堿，取材與獲取方便，以往研究發現該藥具有多種作用，除具有明確抗炎作用外[3]，近年來研究較多的是抗腫瘤作用，研究證實其對肝癌、胃癌、乳腺癌等均具有抑制作用[4-8]，也有少數學者研究證實小檗堿對高血壓導致心室重塑[9]、糖尿病[10-11]、精神分裂癥[12]等亦有效。

筆者研究發現，Ber對肝癌細胞SMMC-7721有顯著的抑制作用，這種抑制作用可能與上調bax蛋白、bax/bcl-2比值及下調bcl-2蛋白表達有關。通過采用不同時間、不同濃度Ber作用于體外培養的人肝癌SMMC-7721細胞后，發現Ber可以在體外抑制人肝癌細胞的增殖，特別是在48h最為明顯。同時發現，Ber通過高表達bax、低表達bcl-2來介導肝癌細胞SMMC-7721凋亡，從而證實了與文獻中Ber對肝癌細胞等有抑制作用類似[1,4]。然而，Ber通過何傳導通路來抑制肝癌細胞SMMC-7721，需要進一步研究。