機械牽拉對角膜成纖維細胞氧化應激、炎性因子和MMP-9表達的影響

李曉娜，宋一菲，史佩佩，宋 婕，陳維毅，賀 瑞

(1.太原理工大學 生物醫學工程學院，太原 030024；2.山西省眼科醫院 準分子激光室，太原 030002)

圓錐角膜(keratoconus)是一種以角膜基質變薄、失去正常弧度而發生錐形變形為特征的角膜擴張性疾病，是眼科臨床常見的致盲疾病之一。其臨床表現為不規則散光和高度近視，視力嚴重受損，部分患者不得不接受角膜移植。目前圓錐角膜的發病機制尚不清楚。一般認為遺傳因素預先存在，環境因素(揉眼、佩戴角膜接觸鏡、紫外線損傷等)作為“誘因”誘發圓錐角膜的發生發展[1]。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是細胞內多種氧化還原反應的正常代謝產物，其產生和清除處于動態平衡狀態。當機體受到有害刺激時，體內活性氧生成累積過多，超出細胞清除能力，細胞氧化與抗氧化系統平衡失調，則導致氧化應激的發生。氧化應激可引起炎癥介質的過度釋放，過度或慢性炎癥刺激會引起組織蛋白酶表達增加，降解細胞外基質，破壞組織結構和微環境，使組織穩態失衡。對體外培養的圓錐角膜患者的角膜細胞[2-4]、角膜組織[5-6]及血清[7-8]的研究均提示氧化應激在圓錐角膜病理過程中扮演了一定角色。自由基的持續產生能夠激活包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶促防御系統，使自由基維持在較低水平，防止細胞發生氧化損傷。研究表明，圓錐角膜患者角膜基質細胞抗氧化酶表達量明顯低于正常人，Nrf2-ARE信號通路活化缺陷與基質降解酶表達增高密切相關[4]。此外，圓錐角膜上皮細胞可能存在細胞自噬障礙，而細胞自噬是細胞對氧化應激損傷的一個自我保護的防御反應，被氧化應激損傷的蛋白和細胞器如不能及時清除，則加重氧化應激損傷[9]。

研究發現圓錐角膜患者淚液中或血清中的炎癥介質，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白介素(interleukin,IL)-1/-4/-5/-6/-8/-17、細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)、血管細胞黏附分子(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)等均顯著高于正常人群[10-13]。采用環孢素A可降低圓錐角膜患者淚液中TNF-α、IL-6和基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-9的表達，延緩圓錐角膜病情的進展[14]。上述研究提示炎性因子參與了圓錐角膜的病理過程。

角膜是典型的承載組織，生物力學因素在圓錐角膜發病中的作用不可忽視。圓錐角膜局部組織變薄、結構破壞、材料性能降低，將導致角膜內部應力發生重新分布。角膜變薄區域在眼內壓的作用下容易發生應力集中，導致材料疲勞失效。若患者伴有用力揉眼習慣，則可能進一步改變角膜受力環境，如角膜粘度降低，眼壓瞬間升高等，這都將增加角膜發生更大形變的風險[15]。應力與生長、疾病之間關系密切[16]，研究表明力學因素在青光眼等眼科疾病中的發揮了重要作用[17-18]。前期研究發現，圓錐角膜成纖維細胞IL-6、TNF-α及MMPs表達明顯高于正常細胞[19-20]，機械牽拉可促進角膜成纖維細胞和MMPs表達，機械牽拉和炎癥介質聯合作用可進一步使MMPs表達上調[21-23]。力學刺激可介導心血管和肺組織等氧化應激反應及炎癥介質釋放，與動脈粥樣硬化和呼吸機相關性肺損傷等疾病密切[24-25]。力學環境改變是否引起角膜細胞氧化應激和炎性因子釋放，進而導致角膜基質降解、促進圓錐角膜的發生發展尚不清楚。

1 實驗材料和方法

1.1 主要試劑

改良Eagle(Dulbecco’s modification of Eagle’s medium,DMEM)/F12培養基(美國Hyclone公司)、胎牛血清(美國Gibco公司)、胰蛋白酶(美國Gibco公司)、Ⅱ型膠原酶(美國Sigma公司)、TRIZOL及Prime-ScriptTMRT RNA 檢測試劑(寶生物工程(大連)有限公司)、酶聯免疫分析試劑盒(ELISA)(上海酶聯生物科技有限公司)、2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)(美國Sigma公司).

1.2 人角膜成纖維細胞的提取及培養

1例正常人(normal cornea,NC)及2例圓錐角膜患者角膜組織(keratoconic cornea,KC)取自山西省眼科醫院，均為角膜移植術后的廢棄組織。機械剝離角膜上皮和內皮層，PBS溶液反復清洗后，用質量濃度1 mg/mL Ⅱ型膠原酶的培養基消化，直至組織塊完全消失，鏡下可見單個細胞時終止消化。2 000 r/min離心5 min，棄上清，加入體積分數10%胎牛血清的DMEM/F12，并置于37 ℃、體積分數5% CO2孵箱內培養，本實驗采用3～5代的角膜細胞。

1.3 細胞力學加載實驗

采用柔性基底拉伸系統Flexcell 4000(美國Flexcell公司)對角膜成纖維細胞施加頻率0.1 Hz、幅度15%、時間12 h周期性機械牽拉載荷，以未加載的靜態培養為對照。

卸載后，收集條件培養基上清進行蛋白檢測；PBS清洗細胞后，分別用TRIZOL裂解收集RNA或進行熒光染色。

1.4 細胞內活性氧自由基(ROS)檢測

PBS清洗細胞，加入適量濃度為10 μmol/L DCFH-DA工作液，37 ℃孵育30 min，其間每隔10 min晃動一次，使探針充分進入細胞內反應。PBS清洗，熒光倒置顯微鏡(IX-70，Olympus，日本)下進行觀察、拍照。采用Image Pro Plus 5.2軟件對熒光強度進行量化，以平均光密度(optical density,OD)值來表示ROS水平的高低。

1.5 酶聯免疫分析(ELISA)法測定炎性因子和MMP-9含量

BCA法測定條件培養基中的總蛋白含量，采用ELISA方法檢測條件培養基中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-9的表達。ELISA試劑盒按說明書進行操作檢測。采用酶標儀(MULTISKIN GO,美國Thermo Fisher Scientific公司)在450 nm精度波長下測量OD值，根據標準曲線計算獲得樣本蛋白含量。

1.6 熒光實時定量PCR檢測抗氧化酶基因表達

收集細胞裂解液，提取總RNA，使用Prime-ScriptTMRT試劑盒進行反轉錄獲得cDNA.采用熒光實時定量PCR(StepOne Plus，ABI，美國)檢測SOD-2、HO-1、NQO-1的mRNA表達，并以管家基因GAPDH作為內參。檢測基因的引物序列為：GAPDH上游序列為5′-GCACCGTCAAGGCTGA-

本試驗采用黑龍江農墾總局八五七農場科技園的空育131等13種水稻品種，各品種均為移栽，田地條件、施肥量、田間管理等基本相似。種植時間為2010年5月15日-5月17日。由于當年高溫，所有的水稻的主莖葉都比正常時的水稻少1片葉。各品種的名稱及水稻葉片數如表1所示。

GAAC-3′，下游序列為5′-TGGTGAAGACGCCAG-

TGGA-3′；SOD-2上游序列為5′-CCTAACGGTGGTGGAGAACC-3′，下游序列為5′-CTGAGCCTTGGACACCAACA-3′；HO-1上游序列為5′-CAG-

TGCCACCAAGTTCAAGC-3′，下游序列為5′-CTGGATGTTGAGCAGGAACG-3′；NQO-1上游序列為5′-AAGCCGCAGACCTTGTGATA-3′，下游序列為5′-TGGCAGCGTAAGTGTAAGCA-3.PCR反應條件為：95 ℃預變性30 s，1個循環；95 ℃變性5 s，60 ℃退火、延伸30 s，40個循環。采用2-ΔΔCT法對基因表達進行相對定量分析。

1.7 數據統計分析

實驗結果以均值±標準差表示，采用SPSS 20.0統計分析軟件中的單因素方差分析法比較不同組間是否存在統計學差異，P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 機械牽拉對角膜成纖維細胞氧化應激水平及抗氧化酶表達的影響

如圖1所示，靜態培養條件下，兩例KC細胞ROS 熒光強度明顯高于NC細胞，平均OD值分別是NC組的1.28倍和1.21倍(均P<0.05).周期性牽拉使NC和KC2細胞ROS熒光強度顯著增加，平均OD值分別是各自靜態培養組的1.25倍和1.45倍(均P<0.05)；KC1則無統計學差異(P>0.05).

如圖2所示，靜態培養條件下，與NC細胞比較，KC1細胞抗氧化酶基因表達水平均較低，SOD-2，HO-1，NQO-1分別為NC細胞的0.68倍(P>0.05)，0.29倍(P<0.05)，0.45倍(P<0.05)；而KC2細胞抗氧化酶的表達則均較高，SOD-2，HO-1，NQO-1分別為NC細胞的3.33倍(P<0.05)，1.85倍(P<0.05)，1.23倍(P>0.05).

周期性牽拉可顯著上調NC細胞HO-1和NQO-1基因表達，其相對表達量分別是靜態培養組的2.65倍和2.50倍(P<0.05)；SOD-2表達則無顯著變化(P>0.05).KC1與NC表達趨勢類似。KC2細胞表現則不同，周期性牽拉使SOD-2和HO-1基因相對表達量下調，分別是靜態培養組的0.86倍和0.22倍(P<0.05)；NQO-1則未見顯著變化(P>0.05).

所有值均以NC靜態組比較；#P<0.05，靜態培養條件下KC組與NC組比較；*P<0.05，牽拉組與各自靜態對照比較圖1 周期性牽拉對正常人及圓錐角膜患者角膜成纖維細胞ROS水平的影響Fig.1 Effects of cyclic stretch on the ROS level in normal and keratoconic corneal fibroblasts

2.2 機械牽拉對角膜成纖維細胞炎性因子及MMP-9表達的影響

如圖3所示，靜態培養條件下，KC1和KC2細胞IL-6蛋白表達量均顯著高于NC細胞，分別為NC細胞的1.59倍和1.30倍(均P<0.05)；TNF-α蛋白表達與IL-6類似，KC1和KC2細胞的表達量分別為NC細胞的1.25倍和1.29倍(均P<0.05)； KC2細胞IL-1β蛋白表達顯著高于NC細胞(P<0.05)，KC1細胞則無顯著變化(P>0.05).

周期性牽拉使NC、KC1、KC2細胞IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達均顯著上調。與各自的靜態培養組比較，IL-1β分別增加了16%、4%和37%(均P<0.05)；IL-6分別增加了54%、5%和8%(均P<0.05)；TNF-α分別增加了43%、16%和20%(均P<0.05).

所有值均與NC靜態培養組比較；#P<0.05，靜態培養條件下KC組與NC組比較；*P<0.05，牽拉組與各自靜態對照比較圖2 周期性牽拉對正常人及圓錐角膜患者角膜成纖維細胞抗氧化酶SOD-2、HO-1和NQO-1基因表達的影響Fig.2 Effects of cyclic stretch on the gene expression of antioxidant enzymes SOD-2, HO-1 and NQO-1 in normal and keratoconic corneal fibroblasts

靜態培養條件下，KC1和KC2細胞MMP-9的蛋白表達均顯著高于NC細胞，分別是NC細胞的1.30倍和1.16倍(均P<0.05).周期性牽拉使NC細胞及KC2細胞MMP-9蛋白表達顯著上調，與靜態培養組比較，分別增加了31%和17%(均P<0.05)；KC1細胞則無顯著變化(P>0.05).

3 討論

本文主要探索了力學刺激對正常人及圓錐角膜患者角膜成纖維細胞氧化應激、炎性因子及MMP-9表達的影響。角膜處于各種有應激源的環境當中，如接觸鏡的佩戴、紫外照射等。圓錐角膜患者不僅細胞內存在較高水平的ROS[2-4]，角膜組織[5-6]甚至整個機體內[7-8]氧化應激水平也均偏高。力學刺激可通過氧化應激及炎癥介質釋放參與動脈粥樣硬化和肺損傷等病理過程[24-25]。本文的研究表明周期性牽拉也是角膜細胞一種產生氧化應激和炎性因子的重要來源之一。

所有值均與NC靜態培養組比較；#P<0.05，靜態培養條件下KC組與NC組比較；*P<0.05，牽拉組與各自靜態對照比較圖3 周期性牽拉對正常人及圓錐角膜患者角膜成纖維細胞炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α及MMP-9蛋白表達的影響Fig.3 Effects of cyclic mechanical strain on the protein expression of inflammatory cytokines IL-1β, IL-6, TNF-α and MMP-9 in normal and keratoconic corneal fibroblasts

本文研究發現KC細胞的ROS熒光強度明顯高于NC細胞，這與文獻[4]報道的結果一致，提示圓錐角膜成纖維細胞本身存在較高的氧化應激水平。抗氧化酶系統可降低自由基水平，保護細胞防止發生氧化損傷。其中，HO-1可通過催化形成膽綠素、膽紅素、鐵離子來清除體內的自由基，是維持氧化和抗氧化動態平衡的關鍵因素，被認為氧化應激中一種高度敏感和可靠的指標。SOD可使超氧陰離子發生歧化作用轉化為H2O2，再經體內過氧化氫酶和過氧化物酶的分解轉化為水和氧氣。NQO-1可借助NADH或NADPH作為電子供體，催化醌類物質發生還原反應，降解醌類及其衍生物，阻止其進一步參與氧化還原反應和ROS的產生，發揮抗氧化應激作用[26-27]。本研究發現正常和圓錐角膜細胞SOD2、HO-1和NQO-1等3種抗氧化酶的表達呈現出多樣化。與NC細胞相比，KC1細胞的3種抗氧化酶基因表達水平均較低，其中HO-1、NQO-1顯著降低；而KC2細胞的3種抗氧化酶基因表達水平則均較高，其中SOD2，HO-1顯著增高。這可能與不同患者的病程、病因以及個體差異有關。周期性牽拉后NC和KC細胞均表現出ROS水平上調，正常細胞在受牽拉后能夠通過上調抗氧化酶的表達清除ROS，雖然KC1在受到力學刺激后抗氧化酶表達也能上調，但因其靜態培養條件下本身抗氧化酶水平就較低，較小幅度的增加量不足以清除過量的自由基，同樣會引起氧化損傷。KC2細胞在牽拉后則表現為抗氧化酶表達顯著降低或無明顯變化，提示其抗氧化系統活化可能存在一定缺陷，且KC2細胞在受牽拉后ROS水平顯著高于NC和KC1細胞。圓錐角膜細胞的這兩種情況均可能導致超氧化物和過氧化氫等過度累積，使角膜細胞和組織容易受到氧化損傷。

臨床及體外實驗研究提示炎癥介質參與了圓錐角膜的發生發展過程。本研究發現圓錐角膜細胞的炎癥介質IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-9的表達顯著高于正常人，這與文獻[10-14,19-20]報道一致。周期性牽拉使上述指標進一步上調。炎癥介質可通過調節蛋白酶及其抑制劑等表達影響細胞外基質的重塑。本研究的前期工作表明，TNF-α在促進圓錐角膜成纖維細胞MMPs表達的同時顯著降低了TIMPs表達，導致二者表達失衡[19]；同時TNF-α還可以通過IL-6調節MMP-1表達[20]，使角膜基質趨于降解；周期性牽拉與PGE2聯合作用可下調圓錐角膜細胞賴氨酰氧化酶家族基因表達，影響角膜膠原交聯[22]。這表明炎性因子可通過促進MMPs表達，并使之與TIMPs失衡，或引起膠原蛋白交聯障礙，進而造成角膜基質降解、降低角膜組織力學結構的穩定性，導致圓錐角膜的發生或促進角膜進一步膨隆。

氧化應激與炎癥之間可相互作用，互相促進，共同加重組織損傷。一方面，氧化應激與線粒體功能障礙可以刺激炎癥反應的發生, 并加重炎癥反應。氧化應激可以刺激角膜上皮細胞IL-6和MMP-9基因及蛋白表達，但使TIMP-1、COLIVA1和LOX表達下調，與圓錐角膜患者上皮表現類似[9]；另一方面，炎癥介質在炎癥部位持續存在，又會激發慢性氧化應激，降低細胞的抗氧化能力。研究表明IL-1α可下調圓錐角膜基質細胞SOD3表達[28]。氧化應激介導的炎癥反應調控途徑非常復雜，氧化應激可通過激活炎性小體、Toll樣受體蛋白家族、NF-κB信號途徑或擾亂轉錄因子NF-E2相關因子抗氧化信號通路等機制介導炎性因子的釋放[29-30]。進一步研究力學刺激引起的氧化應激對炎性因子表達調控的分子機制，將有助于深入了解圓錐角膜的發病機理，為臨床診治提供有價值參考。

本研究具有一定的局限性。首先，正常人及圓錐角膜患者角膜樣本數量有限(正常角膜1例，圓錐角膜2例)，且不同患者的病情有所不同；此外，體外力學刺激僅在一定程度上模擬角膜組織的在體環境，并不能代表角膜的真實受力情況。因此，結果解釋時仍需謹慎。

研究結果提示圓錐角膜的發生發展可能與氧化應激及炎性因子表達上調有關，力學刺激可進一步促進炎性因子和蛋白酶表達，加速基質降解。因此有效控制氧化應激和炎性因子可能成為治療圓錐角膜的潛在靶點。