鞘氨醇1-磷酸鹽受體拮抗劑（FTY720）對咪喹莫特誘導的銀屑病樣小鼠模型皮膚中γδT細胞的作用研究

覃慧 鄭捷

上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院皮膚科 200025

目前銀屑病的發病機制尚不完全清楚，但普遍認為皮損中存在的炎癥性細胞因子如白細胞介素（IL）17A、IL-17F、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、IL-22及分泌IL-23 的樹突細胞、單核細胞在疾病發生發展中起著關鍵作用[1]。研究表明，缺乏γδT 細胞的小鼠在IL-23 或咪喹莫特（imiquimod，IMQ）刺激下皮膚表皮厚度和炎癥明顯減輕[2]，銀屑病小鼠模型真皮中的γδT 細胞具有遷移能力，在穩定狀態下，小鼠淋巴結中部分分泌IL-17 的γδT 來源于皮膚，提示IL-17+γδT 細胞在皮膚和淋巴結間可能存在動態變化[3-4]。皮膚淋巴細胞抗原（cutaneous lymphocyte antigen，CLA）特異性表達于具有組織遷移能力的細胞，介導細胞歸巢至組織。鞘氨醇1-磷酸鹽（sphingosine-1-phosphate，S1P）受體拮抗劑（FTY720）能有效下調表達于致病性T 淋巴細胞上的S1P受體1（S1P1），抑制細胞的遷移，降低炎癥因子的產生[5-7]，但其是否可通過阻斷組織之間致病性細胞的交流以緩解銀屑病的報道較少。本研究通過研究FTY720對銀屑病小鼠模型的治療作用及分子機制，為FTY720 進一步應用于銀屑病治療提供理論依據。

材料與方法

一、主要試劑和儀器

IMQ（美國3M 公司），FTY720、膠原蛋白酶Ⅳ、透明質酸酶、DNA酶Ⅰ（美國Sigma公司），RPMI 1640培養基（美國GIBCO 公司），胎牛血清（FBS，美國GIBCO公司），淋巴細胞分離液（Ficoll，美國Biowest公司），固定/破膜（Fixation/Permeabilization）工作液、10×洗液（10×Wash buffer）、高爾基體抑制劑（Golgiplug，美國Biolegend公司）。流式抗體為大鼠抗小鼠單抗，由美國Biolegend 公司生產，主要有Fc-blocker、PE 標記的 CLA（CLA-PE）、Percp/cy5.5標記的 CD3（CD3-Percp/cy5.5）、APC 標記的 S1P1（S1P1-APC）、APC 標記的γδ（γδ-APC）、APC/cy7 標記的 Viability Dye（Viability Dye-APC/cy7）、PE/cy7標記的IL-17（IL-17-PE/cy7）、PE/cy7標記的γδ（γδ-PE-cy7）、PE/cy7 標記的IgG1（IgG1-PE/cy7）、FITC標記的CD45（CD45-FITC）、APC 標記的Gr1（Gr1-APC）、PE/cy7標記的CD11b（CD11b-PE/cy7）。40 μm無菌細胞篩（美國VWR公司），流式細胞儀（CantoⅠ，美國BD公司）。

二、實驗動物

8 只 6 ～ 8 周齡、體重 18 ～ 20 g、SPF 級雌性C57BL/6 小鼠購自美國Charles River 實驗室，飼養于美國University of Louisville 動物房SPF 環境，動物實驗許可證號（Institution Animal Care and Use Committee：16574）。按小鼠體重隨機分為 2 組，小鼠每只耳朵涂抹10 mg/d IMQ，連續涂7 d，實驗組3 只小鼠于第2（D1）、4、6 天腹腔注射FTY720，對照組5 只小鼠注射無菌磷酸鹽緩沖液（1 × PBS，pH7.4）。PBS用量為200 μl，FTY720用量為1 mg/kg，溶于PBS[8]。在實驗過程中由D0至D7每天測量鼠耳厚度，D7處死小鼠，取雙耳皮膚及雙側頸部引流淋巴結。腹腔注射FTY720及測量耳厚度均在當天涂抹IMQ之前進行。

三、方法

1.鼠耳朵皮膚組織病理：小鼠處死后取耳朵1 cm × 0.5 cm 皮膚組織，包埋冰凍組織塊，切片后-80 ℃保存。取冰凍切片行常規HE 染色，光鏡下觀察。取冰凍切片，-20 ℃丙酮固定30 min，通風干燥 30 min，置于 5 片式染缸，PBS 洗 3 次，滴加20% FBS，于4 ℃封閉過夜，PBS 洗1 次后加入Gr1單抗（1∶100稀釋），4 ℃避光過夜，PBS洗3次，吸取表面殘留水珠，滴加DAPI染色10 min，PBS洗3次，滴加防淬滅劑，封片。熒光顯微鏡下觀察結果并拍照。

2.皮膚細胞獲取：處死小鼠后剪下雙耳皮膚并剪成肉糜狀，與皮膚消化酶（膠原蛋白酶Ⅳ、透明質酸酶、DNA酶Ⅰ）中37 ℃旋轉消化2 h，采用2 ml針筒內芯研磨，通過40 μm 無菌細胞篩，1 800 r/min（離心半徑14 cm，離心半徑下同）離心7 min，棄上清液。采用3 ml完全培養液（RPMI 1640，10%FBS）重懸，加入3 ml淋巴細胞分離液，于室溫下2 000 r/min離心15 min，吸取中間絮狀層和下層粒細胞層加入6 ml 完全培養液，1 800 r/min 離心 7 min，棄上清液。1 ml完全培養液重懸，計數后用于流式細胞儀檢測。

3.頸部引流淋巴結細胞獲取：處死小鼠后沿腹中線剪開小鼠皮膚直至下頜，取小鼠頸部淋巴結左右各 3 個置于 RPMI 1640 完全培養液，2 ml 針筒內芯研磨后通過 40 μm 無菌細胞篩，1 500 r/min 離心5 min，棄上清液。1 ml 完全培養液重懸，計數后用于流式細胞儀檢測。

4.流式細胞儀檢測中性粒細胞比例：皮膚細胞懸液中取1×106個細胞，加入1ml PBS，1 500 r/min離心5 min，棄上清液。加入2 μl Fc-block 4 ℃孵育10 min。加入 Viability Dye-APC/cy7、CD45-FITC、Gr1-APC、CD11b-PE/cy7，4 ℃避光孵育20 min，加入1 ml PBS，1 500 r/min 離心 5 min，棄上清液。加入100 μl PBS 重懸后于流式細胞儀檢測中性粒細胞比例。

5.流式細胞儀檢測皮膚細胞中CD3+T、γδT細胞比例及淋巴結細胞中CLA、S1P1 的表達：皮膚細胞懸液或淋巴結細胞中取1×106個細胞，加入1 ml PBS，1 500 r/min離心5 min棄上清液。加入2 μl Fcblock 4 ℃孵育10 min。加入Viability Dye-APC/cy7、CD3-Percp/cy5.5、γδ-PE-cy7、CLA-PE、S1P1-APC，4 ℃避光孵育20 min，加入1 ml PBS，1 500 r/min 離心5 min，棄上清液。加入100 μl PBS 重懸后FACS CantoⅠ檢測 CD3+T、γδT 細胞比例及 CLA、S1P1表達。

6.流式細胞儀檢測CD3+T、γδT 細胞中IL-17+細胞比例：皮膚細胞懸液或淋巴結細胞懸液中取2×106個細胞，加入24孔培養板中，加入完全培養基補足至1 ml，皮膚細胞懸液加入Golgiplug 1 μl，37 ℃，5% CO2培養箱培養4 h 后收集細胞至流式管。1 500 r/min 離心 5 min，棄上清液。加入2 μl Fc-block 4 ℃孵育10 min。加入CD3-Percp/cy5.5、γδ-APC、Viability Dye- APC/cy7、IL-17-PE/cy7 4 ℃孵育20 min。加入1 ml PBS 1 500 r/min離心5 min。盡量棄上清液后加入 400 μl 固定/破膜（Fixation/Permeabilization）工作液400 μl，室溫20 min。加入1 ml 1× 洗液1 500 r/min 離心5 min，棄上清液，重復2 次。樣本管加入IL-17-PE/cy7，同型對照管中加入相對應的同型對照，4 ℃冰箱孵育至少45 min。1 ml 1×洗液1 500 r/min離心5 min，棄上清液。加入100 μl 1 × 洗液重懸后流式細胞儀檢測IL-17+CD3+T、γδT細胞的比例。所有流式結果應用Flow J軟件分析。

四、統計學方法

采用Graphpad Prism 6.0軟件，計量資料以±s表示，數據中符合正態分布的資料用t檢驗，不符合正態分布采用非參數檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、FTY720 對銀屑病小鼠耳朵皮膚組織學的影響

D2 時實驗組小鼠耳厚度明顯低于對照組（t=4.23，P＜ 0.01），直至D7 實驗組小鼠耳厚度均低于對照組（P＜ 0.01）。見圖1。

小鼠耳組織切片HE 染色顯示，實驗組小鼠耳表皮厚度（18.62 μm ± 0.19 μm）低于對照組（27.79 μm ± 1.58 μm），t= 4.35，P＜ 0.01（圖 2A）。免疫熒光染色顯示，實驗組小鼠耳組織中性粒細胞浸潤程度低于對照組（圖2B）。流式細胞儀檢測小鼠耳組織中性粒細胞比例。結果顯示，實驗組中性粒細胞比例（1.57%±0.12%）低于對照組（3.03%±0.33%），t=3.31，P=0.016（圖2C）。

二、FTY720對銀屑病小鼠耳皮膚細胞、頸部引流淋巴結細胞中細胞比例的影響

流式結果顯示，實驗組小鼠皮膚中CD3+、γδT細胞比例均低于對照組（t= 3.98、2.75，P＜ 0.05），見圖3，CD3+細胞、γδT 細胞中IL-17+細胞比例亦均低于對照組（t= 6.89、10.27，P＜ 0.001），αβT 細胞中IL-17+細胞比例與對照組差異無統計學意義（t=0.184，P= 0.86），見圖4。引流淋巴結中，實驗組γδT 細胞比例高于對照組（t= 5.781，P= 0.001），γδT 細胞中IL-17+細胞比例亦高于對照組（t=4.140，P=0.006），見圖5。

圖1 C57BL/6 小鼠耳涂抹咪喹莫特（IMQ）后腹腔注射FTY720 對耳厚度的影響 實驗組n=3；對照組n=5。a：兩組比較，P ＜ 0.01

三、FTY720對引流淋巴結中γδT細胞S1P1及CLA表達影響

流式結果顯示，實驗組γδT 細胞S1P1、CLA 平均熒光強度均低于對照組（t值分別為50.55、31.64，P＜ 0.000 1）。見圖6。

討 論

圖2 FTY720 對咪喹莫特（IMQ）誘導銀屑病小鼠耳皮膚組織的影響 2A：實驗組小鼠耳組織表皮厚度低于對照組（HE×10）；2B：免疫熒光染色顯示，實驗組小鼠耳組織中性粒細胞浸潤程度低于對照組（圖中比例尺單位為50 μm）；2C：流式細胞儀檢測小鼠耳組織細胞中中性粒細胞比例

圖3 流式細胞儀檢測咪喹莫特（IMQ）誘導及腹腔注射FTY720后C57BL/6小鼠耳皮膚CD3+、γδT細胞比例 a：兩組比較，P ＜0.05

圖4 流式細胞儀檢測咪喹莫特（IMQ）誘導及腹腔注射FTY720后C57BL/6小鼠耳皮膚CD3+細胞、γδT、αβT細胞中IL-17+細胞比例 兩組比較，a：P ＜ 0.05，b：P ＞ 0.05

圖5 流式細胞儀檢測咪喹莫特（IMQ）誘導及腹腔注射FTY720后C57BL/6小鼠引流淋巴結中γδT細胞及IL-17+γδT細胞比例 a：兩組比較，P ＜ 0.05

圖6 流式細胞儀檢測咪喹莫特（IMQ）誘導及腹腔注射FTY720后C57BL/6小鼠引流淋巴結中 γδT 細胞S1P1、CLA 平均熒光強度 實驗組γδT 細胞S1P1、CLA 平均熒光強度均低于對照組（P ＜ 0.001）

銀屑病是一種機制未明的炎癥性皮膚病，抑制炎癥細胞浸潤、控制炎癥因子產生及進行免疫調節是當前銀屑病治療的主要策略[9]。目前針對IL-17及其受體的生物治療在治療銀屑病中已取得良好效果[10]。由于S1P1在細胞遷移浸潤中發揮重要作用[11]，提示FTY720可通過抑制S1P1的表達減少炎癥細胞的浸潤以達到緩解銀屑病的目的。本研究顯示，FTY720 的使用可以顯著緩解銀屑病小鼠皮膚增厚，降低表皮厚度，減少中性粒細胞浸潤，并降低皮膚中T細胞分泌IL-17水平，表明FTY720可以顯著緩解小鼠銀屑病臨床癥狀且能降低主要致炎因子IL-17的水平。既往研究表明，IL-23皮內注射或IMQ局部涂抹誘導的小鼠銀屑病模型中，真皮層中的γδT細胞是分泌IL-17的最主要細胞[12]。本研究采用IMQ誘導小鼠銀屑病模型也發現，分泌IL-17的主要細胞是γδT 細胞，且FTY720 可顯著降低γδT細胞分泌IL-17水平，提示FTY720通過降低分泌IL-17 的γδT細胞來緩解銀屑病的癥狀。

S1P 與表達于多種免疫細胞上的S1P 1 ～5 結合以介導細胞遷移[13]。研究表明，FTY720 能通過抑制S1P1表達抑制特異性免疫細胞αβT細胞由淋巴結遷出，進而顯著降低其在血液循環中的數量[14]，降低炎癥因子的分泌[5，15]。FTY720在小鼠腦梗死模型中也有很好的治療效果，可能的機制在于其能有效抑制γδT 細胞在腦部病灶的浸潤[16]。但是γδT 細胞是否也是通過S1P1進行遷移以及被抑制的γδT細胞去向如何均報道較少。本研究發現，FTY720 處理組 γδT 細胞表達 S1P1 顯著下調，引流淋巴結中γδT、IL-17+γδT 細胞比例明顯升高，而皮膚組織中γδT、IL-17+γδT 細胞均明顯減少，提示抑制 γδT 細胞 S1P1 的表達可將 γδT 細胞限制于引流淋巴結而減少其在皮膚組織中的比例。而FTY720顯著下調引流淋巴結γδT 表面CLA 表達，也提示γδT細胞歸巢至皮膚組織能力降低。

本研究顯示FTY720的使用升高引流淋巴結中γδT 細胞比例，同時降低其在皮膚中的比例，提示FTY720可能有抑制引流淋巴結中γδT細胞向皮膚浸潤的能力，隨后我們將進一步對此觀點進行驗證。IMQ 誘導的小鼠銀屑病模型盡管是目前研究銀屑病最為廣泛的動物模型，但不能完全代替人發生的銀屑病，因此研究FTY720 對人銀屑病的治療效應及分子機制將是我們接下來工作的方向。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突