姜黃素逆轉系統性紅斑狼瘡患者外泌體誘導的巨噬細胞吞噬功能受損

張淑娟 唐亞萍 梁景耀 劉玉梅

廣州市皮膚病防治所皮膚科 510095

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種常見的累及多系統多器官的自身免疫性疾病[1]。早期研究認為，淋巴細胞異常是SLE發病的主要機制，近年固有免疫包括巨噬細胞的功能異常被逐漸重視[2]。SLE患者巨噬細胞清除凋亡細胞的能力下降，具有免疫原性的凋亡碎片大量累積，誘導淋巴細胞啟動自身免疫反應[3]。Ren 等[4]發現，SLE 患者血清可誘導中性粒細胞凋亡，并下調正常巨噬細胞清除凋亡細胞的能力。Lee等[5]在后續研究中發現，SLE血清主要通過血液循環中外泌體起促炎癥免疫反應的作用。姜黃素（curcumin）是從姜科、天南星科中的一些植物的根莖中提取的一種化學成分，為多酚類化合物，國內外研究表明其具有較強的抗腫瘤[6]及抗炎[7]作用。研究發現，姜黃素可通過上調巨噬細胞CD14表達，從而增強其吞噬功能[8]。本研究探討姜黃素能否逆轉SLE 患者外泌體誘導的巨噬細胞吞噬功能受損，為SLE的治療提供新的線索。

對象與方法

一、研究對象

收集2016年2月至2017年11月廣州市皮膚病防治所和中山大學孫逸仙紀念醫院診治的活動期SLE 患者18 例，年齡（28.4 ± 5.5）歲，病程中位數為23（P25，P75：3.75，35.0）個月，均為女性。診斷符合1997年美國風濕病協會（ACR）修訂的SLE 分類標準，并排除其他自身免疫性疾病。SLE疾病活動度評分（SLEDAI）平均為11分，均≥5分。選取18例體檢健康者作為健康對照。兩組受試者年齡、性別差異無統計學意義。本研究經廣州市皮膚病防治所醫學倫理委員會審批通過（201501），所有患者均簽署知情同意書。

二、主要試劑

人急性單核細胞白血病細胞株（THP-1，ATCC?TIB-202?）、RPMI 1640、胎牛血清（FBS）（美國Gibco 公司）、血清外泌體分離液（美國Life Technologies 公司）、佛波酯（PMA）（P8139，美國Sigma-Aldrich 公司）、兔抗人 CD14 單克隆抗體（ab183322，美國abcam 公司）、兔抗人β 微管蛋白（β-tubulin）多克隆抗體（#2146，美國CST 公司）、鼠抗人CD63單克隆抗體（NBP2-42225，美國Novus公司）、鼠抗人 CD81 單克隆抗體（ab79559，美國abcam 公司）、姜黃素（sc-200509，分子量368.38，美國 Santa Cruz 公 司 ）。 pHrodo ? Red 指 示 劑（P35361，美國Life Technologies 公司）用于評估巨噬細胞吞噬功能。

三、方法

抽取受試者外周靜脈血8 ml置于干燥管，靜置30 min，1 500×g離心15 min分離血清，分裝為600 μl一管，凍存于-80 ℃冰箱用于提取外泌體。

1.血清外泌體提取及鑒定：受試者血清外泌體提取及鑒定方法參考文獻[9]。將18 例SLE 患者的外泌體（SLE-exo）每6例一組隨機混合分為3組，18 例健康對照者外泌體（CON-exo）同樣分為3 組。采用透射電鏡觀察提取的外泌體。CD63 與CD81為外泌體特異標記物，取25 μl外泌體采用Western印跡法檢測CD63、CD81水平。

2.巨噬細胞的誘導、刺激及吞噬功能測定：使用含 10% FBS 的 RPMI 1640 培養基培養 THP-1 細胞，加入160 nmol/L PMA 刺激48 h 誘導為巨噬細胞。更換為含0.5%FBS 的RPMI 1640 培養基培養12 h，分為 4 組（SLE-exo 組、SLE-exo + 姜黃素組、CON-exo 組、CON-exo + 姜黃素組），分別以 SLE-exo 25 μl/ml、SLE-exo 25 μl/ml+ 姜黃素20 μmol/L、CON-exo25μl/ml、CON-exo25μl/ml+姜黃素20μmol/L刺激巨噬細胞24 h，檢測刺激后巨噬細胞的吞噬功能。

巨噬細胞吞噬功能測定：pHrodo?Red 在中性環境不發熒光，被巨噬細胞吞噬后進入囊泡后pH下降，pHrodo?Red發出紅色熒光。因此，本文使用pHrodo?Red陽性細胞比例反映具有吞噬功能的巨噬細胞比例；使用細胞平均紅色熒光強度反映巨噬細胞的吞噬功能。巨噬細胞吞噬功能越強，pHrodo?Red 陽性細胞比例越高以及平均熒光強度越強。按照說明書，將pHrodo?Red 與巨噬細胞共孵育2 h，采用流式細胞儀測量熒光強度；采用免疫熒光染色檢測pHrodo?Red 陽性細胞比例，pHrodo?Red陽性細胞比例=（紅色熒光細胞數/DAPI 染色細胞數）×100%，每個樣本隨機取200 倍視野5 個并計算平均值。

3.刺激后巨噬細胞CD14水平：分為5組，CON-exo 組、SLE-exo 組、SLE-exo+ 姜黃素1 μmol/L 組、SLE-exo + 姜黃素 5 μmol/L 組、SLE-exo + 姜黃素20 μmol/L 組，刺激后的細胞使用蛋白提取裂解緩沖液（RIPA）+ 蛋白酶抑制劑（PMSF；1 mmol/L）提取蛋白，SDS-PAGE 電泳并轉膜后，以GAPDH 為內參，檢測CD14蛋白水平。

四、統計學方法

結 果

一、SLE患者血清外泌體及CD63、CD81的表達

分離純化血清外泌體，電鏡下見直徑約100 nm茶托樣囊泡結構，符合外泌體形態（圖1）。Western印跡結果示，SLE組及健康對照組血清外泌體均表達 CD63 及 CD81，SLE 組 CD63 水平高于健康對照組（t=3.26，P=0.03），CD81 水平亦高于健康對照組（t=3.82，P=0.02）。見圖2。

二、姜黃素對SLE患者外泌體刺激后巨噬細胞吞噬能力的影響

將pHrodo?Red 與巨噬細胞共孵育后，流式細胞儀檢測 CON-exo 組、CON-exo + 姜黃素組、SLE-exo 組、SLE-exo + 姜黃素組相對熒光強度分別為101.3% ± 14.05% 、94.27% ± 14.13% 、41.02% ±9.54%、87.33% ± 15.01%，差異有統計學意義（F=10.81，P＜ 0.01），SLE-exo 組低于 CON-exo 組（t=5.26，P= 0.001）和SLE-exo + 姜黃素組（t= 3.97，P=0.004）（圖3），CON-exo 組與CON-exo+ 姜黃素組差異無統計學意義（t=0.61，P=0.570）。

圖1 分離純化的血清外泌體在透視電鏡下表現為直徑約100 nm茶托樣囊泡

圖2 Western 印跡法檢測系統性紅斑狼瘡（SLE）組與健康對照組血清外泌體CD63及CD81的水平 2A：Western印跡法檢測外泌體中CD63、CD81 電泳圖。18 例SLE 患者及18 例健康對照者的外泌體均每6例一組混合，各分為3組，1 ～3：分別為SLE 1 ～3組；4 ～ 6：分別為健康對照1 ～ 3 組；2B：外泌體CD63、CD81 表達水平。a：與健康對照組相比，P ＜0.05

免疫熒光染色檢測CON-exo 組、CON-exo+姜黃素組、SLE-exo組、SLE-exo+姜黃素組pHrodo?Red陽性細胞比例分別為82.16% ± 5.20%、81.33% ±4.51%、54.20% ±9.31%、71.23% ±5.43%，4 組差異有統計學意義（F=12.42，P＜ 0.01），SLE-exo 組低于CON-exo 組（t=5.35，P=0.001）和SLE-exo+ 姜黃素組（t=3.26，P=0.011）。見圖4。

三、姜黃素對SLE患者外泌體刺激后巨噬細胞CD14蛋白水平的影響

圖3 健康對照組外泌體（Con-exo）、系統性紅斑狼瘡患者外泌體（SLE-exo）、Con-exo+姜黃素、SLE-exo+姜黃素刺激巨噬細胞后與pHrodo?Red染色劑共孵育，流式細胞儀檢測熒光強度

圖4 免疫熒光染色檢測健康對照組外泌體（Con-exo）、系統性紅斑狼瘡患者（SLE-exo）外泌體、Con-exo+姜黃素、SLE-exo+姜黃素刺激巨噬細胞后pHrodo?Red陽性細胞比例 DAPI染細胞核，呈藍色熒光，吞噬pHrodo?Red的巨噬細胞呈紅色熒光

CON-exo 組、SLE-exo 組、SLE-exo + 姜黃素1 μmol/L 組、SLE-exo + 姜黃素 5 μmol/L 組、SLE-exo + 姜黃素20 μmol/L 組分別刺激巨噬細胞后，CD14 蛋白水平分別為96.33%±13.65%、30.67%±5.86%、45.24%±8.89%、72.81%±6.62%、90.67%±12.66%，5 組差異有統計學意義（F= 24.57，P＜0.01），SLE-exo 組低于 Con-exo 組（t= 8.06，P＜0.001）、SLE-exo+ 姜黃素5 μmol/L 組（t=5.08，P＜0.001）和SLE-exo + 姜黃素20 μmol/L 組（t= 7.38，P＜ 0.001），隨著姜黃素濃度增加，CD14 水平有升高的趨勢。見圖5。

討 論

單核/巨噬細胞的功能受損在SLE 的發病中發揮重要作用，可以表現為單核/巨噬細胞IL-1β分泌下降，CD80、主要組織相容性復合體Ⅱ（MHCⅡ）表達下降等，而吞噬功能的下降是其經典表現之一[10]。本研究發現，SLE患者外泌體能明顯抑制巨噬細胞吞噬功能并下調巨噬細胞CD14 表達，而姜黃素可逆轉SLE 患者外泌體的作用。外泌體是由細胞分泌的直徑約為30 ～120 nm 的小囊泡，廣泛存在于多種體液包括血液中。RNA 及蛋白可被包裹于外泌體中，避免被降解。血清中外泌體能有效地發揮細胞間信號傳導的作用，外泌體上整合素、細胞間黏附分子1 和MHCⅡ等分子可能參與外泌體的靶向選擇[11]。研究發現，SLE血清外泌體可使外周血單個核細胞炎癥因子（包括α 干擾素、腫瘤壞死因子α、白細胞介素1β、白細胞介素6）分泌增多，而去除外泌體后的血清無上述作用，血清外泌體的水平與SLE 患者的疾病活動呈正相關[5]。本研究也發現，活動期SLE患者組外泌體數量多于健康對照組，并且SLE血清外泌體可能通過抑制巨噬細胞的吞噬功能，參與SLE的發病。

近期研究發現，姜黃素亦能通過調節免疫細胞的功能，對多發性硬化、炎癥性腸病、類風濕性關節炎等自身免疫異常相關的疾病有治療作用[12]，但目前缺乏SLE的相關研究。本研究發現，姜黃素能夠逆轉SLE 患者血清外泌體對巨噬細胞吞噬功能的抑制作用。另外，有研究稱，CD14是巨噬細胞吞噬并清除凋亡細胞的關鍵分子[13]。本研究亦發現，SLE 外泌體可下調巨噬細胞CD14 的表達，且該作用可被姜黃素逆轉。

圖5 健康對照組外泌體（Con-exo）、系統性紅斑狼瘡患者（SLE-exo）外泌體、SLE患者組外泌體與1、5、20 μmol/L姜黃素刺激巨噬細胞后CD14蛋白電泳圖；5B：5組細胞CD14蛋白水平統計圖

綜上所述，本研究發現姜黃素可逆轉SLE外泌體對巨噬細胞吞噬功能的抑制作用，并上調巨噬細胞CD14的表達。上述結果為姜黃素作為SLE的治療藥物提供了有價值的線索，但仍需大量進一步研究的支持。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突