不同DRD2TaqIA基因型美沙酮維持治療的海洛因成癮者島葉功能連接差異的rs-fMRI研究

胡風，王磊，時宏，李小懷，李瑋，李強，王瑋，王亞蓉*

藥物成癮是環境因素、藥源性生理異常、基因易感性多因素綜合作用的結果[1]。以海洛因成癮為代表的藥物濫用構成了嚴重的健康問題，目前仍然沒有找到有令人滿意的治療手段，即使作為主流療法的美沙酮替代治療(methadone maintenance treatment，MMT)也存在著相當顯著的復吸情況[2]。研究表明，成癮過程和治療效果與患者大腦多巴胺系統效能有密切關系，而多巴胺D2受體(dopamine Receptor D2，DRD2) TaqIA基因型(A+、A-型)是調節其效能的重要基因[3]。此外，近年來研究發現島葉是DRD2的主要分布區之一，并且在維持物質成癮行為過程中的重要作用受到關注[4]。但是，目前DRD2TqIA基因型如何通過腦島調節成癮患者成癮行為的機制尚不清楚。因此，本研究以雙側島葉為靜息態功能連接分析的種子區，探討不同DRD2TqIA基因型海洛因成癮者，島葉與全腦功能連接(functional connectivity，FC)的差異，分析DRD2TaqIA基因型調節海洛因成癮者大腦內感受狀態及其與美沙酮維持治療療效的神經機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2012年10月至2013年1月西安市灞橋區美沙酮維持治療門診的男性海洛因依賴患者(heroin dependence，HD)47例，采集被試唾液，采用PCR-RLFP基因技術，分析被試DRD2受體基因，將其分為A+組(27例)和A-組(20例)。兩組間年齡、受教育程度、吸煙史、海洛因濫用史美沙酮維持治療史相匹配(表1)。受試者本人均自愿參加本研究，并于實驗前簽署知情同意書。本研究通過空軍軍醫大學唐都醫院倫理委員會批準。

被試納入標準：(1)所有被試符合美國精神疾病診斷與統計手冊(DSM-V)的物質依賴診斷標準；(2)均為單純海洛因依賴，無海洛因外的非法藥物濫用史，吸食方式采用燙吸和/或靜脈注射；(3)受試者均為男性，右利手：(4)美沙酮維持治療時間不少于一年時間。排除標準：(1)腦器質性病變者及較嚴重頭部外傷史；(2)本人及一級親屬為精神疾病患者；(3)嚴重心肝腎功能不全者；(4) HIV陽性；(5)幽閉恐懼癥及其他核磁共振檢查禁忌者。所有被試在檢查當日均未服用美沙酮，并進行尿檢，以確保處于脫毒期。

1.2 數據采集與處理

1.2.1 DNA收集及DRD2 TaqIA基因分型

MR掃描前采集每個被試唾液樣本，根據畢匹生物科技有限公司R6731-02 Oragene DNA self-collection kit說明收集并保存于冰箱內。DRD2 TaqIA基因多態性測定由美國應用生物系統公司(上海)用TaqMan SNP Genotyping Assay進行測定、分型。

1.2.2 圖像采集

采用美國GE Signa Excite HD 3.0 T磁共振掃描儀和8通道標準頭線圈進行fMRI數據采集。為減少頭動偽影，掃面前要求受試者加墊泡沫海綿及佩戴降噪耳塞。掃描過程受試者仰臥，通過反光鏡平靜注視屏幕上的“+”，盡量保持思維平靜狀態，不能睡眠。rsfMRI掃描用平面梯度回波(echo-planar imaging，EPI)序列，掃描參數：TR 2000 ms，TE 30 ms，矩陣64×64，FOV 256 mm×256 mm，層厚4 mm，層數32，反轉角90°。三維結構像采用FSPGR序列，TR 7.8 ms，TE 3.0 ms，反轉角20°，采集矩陣256×256，層厚1 mm。正式采集數據前10 s空掃以穩定信號，采集150個時間點，掃描時間共持續310 s。

1.2.3 靜息態數據處理

圖像預處理基于MATLAB (R2012a)平臺，采用中科院心理研究所dpabi (Data processing & Analysis for Brain Image)軟件。去除掃描前10×32張圖層，以剔除最初信號不穩定及被試適應過程影響。首先進行時間校正，以第1張全腦圖像為標準進行圖像對齊并進行頭動校正，因掃描時間較長，呼吸、心跳等生理活動會對頭動有所影響，因此被試頭動在任意方向超過2.0 mm或旋轉角度超過2°將被剔除于本研究之外；然后進行圖像配準，按體素3 mm×3 mm×3 mm重采樣，用FWHM 4 mm的高斯平滑核進行空間平滑，減少空間噪聲。最后進行濾波(0.01 Hz＜f＜0.1 Hz)，排除低頻線性漂移以及高頻噪聲(如呼吸、心跳等)。本研究僅關注神經元活動，所以將全腦信號、白質、腦脊液信號作為協變量進行多元回歸分析。

1.2.4 功能連接分析

功能連接(functional connectivity，FC)是一種基于ROI的網絡分析方法，它是基于某種假設或文獻選擇某個腦區作為感興趣區，提取該腦區的平均時間序列信息，然后計算該ROI與全腦其它體素的之間的時間序列相關性。最終根據一定的閾值分析出具有具有統計學意義的關系腦區，這些腦區被認為是該ROI有功能連接的腦區[5]。功能連接的強弱用FC值表示，FC值越強表示該ROI與相關腦區的時間序列的同步性越強。本研究將自動解剖標簽(anatomical automatic labeling，AAL)模板的雙側島葉作為感興趣區，提取每個被試感興趣區的平均時間序列作為種子時間序列，計算該種子時間序列和全腦每個體素時間序列Pearson相關系數。最后利用Fishers'r-to-z轉換將相關系數進行正態性變換，進而得到島葉與全腦的功能連接數據。

圖1 與A-組相比較，A+組右側島葉與全腦功能連接減低的腦區：雙側尾狀核、雙側背外側前額(體素＞5，P＜0.001，FDR校正)Fig. 1 Compared with A- group, A+ group demonstrated reduced FC between the right insula and the bilateral dorsolateral prefrontal cortex, and the bilateral caudate nucleus (cluster size ＞5, P＜0.001, FDR correction).

表1 兩組受試者一般人口學資料(x±s)Tab. 1 Demographic and clinical characteristics of paticipants(x±s)

1.2.5 復吸檢測

以本次實驗fMRI掃描當天為基準，進行為期12個月的回訪，對每個海洛因成癮被試進行每個月固定的尿檢測試及當面訪談，任何一次自我報告存在海洛因使用情況或尿檢陽性即被認定為當月復吸，在本研究中，將實驗完成后至第一次復吸行為發生時間段(月)稱為美沙酮維持治療的操守時間。

1.3 統計學分析

采用SPSS 20.0統計分析軟件，對A+組和A-組間人口學資料和用藥情況做兩樣本t檢驗，計算資料以x±s表示。組間FC值的比，采用dpabi的統計分析軟件，進行A+組和A-組的兩樣本t檢驗(P＜0.001，FDR校正)。將年齡、日均MMT用藥量作為協變量，對組間差異區的FC的連接強度與操守時間進行偏相關分析(P＜0.05為差異有統計學意義，Bonferroni校正)。

2 結果

2.1 人口學資料統計

A+組與A-組人口統計學資料(年齡、受教育程度、吸煙、海洛因及美沙酮使用情況)的比較無統計學意義(P＞0.05)(表1)。

2.2 組間功能連接分析結果

與A-組相比，A+組右島葉與雙側尾狀核、雙側背外側前額葉功能連接強度明顯減低(P＜0.001，FDR校正，體素＞5)，未發現功能連接強度增高的腦區；兩組間左側島葉與全腦功能連接無顯著性差異(圖1，表2)。

表2 A+組比A-組靜息態功能連接差異Tab. 2 Different brain areas of functional connectivity during resting-statse in A+ group vs. A- group

圖2 偏相關結果：右側島葉與右側背外側前額葉FC值強度與MMT操守時間呈正相關(r=-0.378，P=0.011，Bonferroni校正P＜0.05)Fig. 2 The partial correlation demonstrated: FC intensity between the right insula and the right dorsolateral prefrontal cortex had a positive correlation with abstinent time (r=0.378、P=0.011; Bonferroni correction P＜0.05).

2.3 偏相關分析

以年齡、日均美沙酮用量為協變量，右側島葉-右側背外側前額葉功能連接強度與患者美沙酮維持治療的保持操守時間呈正相關(r=0.378，P=0.011；Bonferroni校正，P＜0.05)(圖2)。

3 討論

目前，基因調節的多巴胺受體表達在藥物成癮的神經機制研究中成為重點，尤其是多巴胺D2受體TaqIA基因型，已被證明在中腦邊緣多巴胺環路的獎賞調節過程中處于核心地位，它兩個等位基因分別為A1、A2[6-7]，A1為顯性基因，根據基因組合方式又將其攜帶者分為： TaqIA+型(A1/A1和A1/A2)與TaqIA-型(A2/A2)。流行病調查與研究表明，A+基因型個體更傾向于海洛因、酒精、尼古丁的成癮，相對于A-型基因個體，在治療效果上也有更高的失敗率[8-10]。島葉是調節內感受狀態的核心腦區，在藥物成癮機制的形成中，內感受狀態的異常，會從整體上促使和加重正常的抑制性控制行為向異常的藥物渴求行發生傾斜[11]。然而，目前DRD2TaqIA基因型對MMT海洛因成癮者的內感受狀態的神經調節機制仍不明確。因此，本研對不同DRD2TaqIA基因型成癮者的島葉功能連接差異進行分析，從內感受這一重要角度，探討DRD2TaqIA基因型調節海洛因成癮機制及治療過程中的調節作用。

傳統的理論認為引起藥物使用障礙的兩個過程，包括強化了的藥物顯示的動機驅動過程和減弱藥物線索引出誘導反應趨勢的認知控制過程，而內感受連接了動機驅動和認知控制這兩個過程[12]。最近的一個關于島葉的內感受模型證明：后島葉編碼與動機狀態相關的神經活動，前島葉調節渴求狀態的主觀意識，這些信息被傳遞到前扣帶回、背外側前額葉、額下回，然后由前額葉的這些腦區決定維持目前的行為還是終止它[13]。因此這一模型指出在認知控制過程中，島葉與背外側前額葉的功能連接改變與藥物依賴的機制密切相關。本研究A+型成癮者腦島與雙側背外側前額葉功能連接強度顯著減低，這與以上的經典模型和之前的研究相一致[14]。進一步證明，A+型成癮者的內感受可能具有更弱的協調動機、渴求和認知控制的能力，這種功能連接強度的弱化使A+型成癮者更易由抑制性控制行為轉向藥物渴求狀態，這可能是A+基因型患者在海洛因使用中更容易成癮的重要原因。

前額葉皮層是調節多巴胺中腦邊緣系統獎賞環路的核心腦區，同時參與更高階的認知控制功能(自我監控、突顯意識控制)活動[15]。認知控制功能損傷在藥物濫用的持續性和驅使復吸的過程中有至關重要的角色[16]。事實上，大量的研究將島葉與前額葉的認知控制過程連接起來[17-18]。例如，研究表明右側島葉與前扣帶回的相互作用在默認模式和認知控制網絡之間的轉換至關重要[19]。前島葉在調節未知過程和追蹤危險中的重要性[20]。這些發現強調島葉與前額葉的重要腦區(額上回、額下回、背外側前額葉等)共同參與并調節認知控制的過程。筆者研究發現A+型成癮者右側島葉與背外側前額葉表現出更低的功能連接強度，說明A+型成癮者背外側前額葉對內感受沖突監測能力減低，在美沙酮維持治療過程中，A+型成癮者也許在調節注意力控制能力和整合覓藥沖動與抑制關系的能力上，相對于A-組均表現減低。此外，筆者發現在MMT過程中右側島葉與背外側前額葉功能連接的強度和MMT保持操守時間呈正相關，說明相對于A-組，A+型成癮者堅持不復吸的時間更短。因此，島葉和背外側前額葉這種腦區功能連接的減弱，最終使A+型海洛因成癮者在強迫性覓藥行為中有更低的抵抗性，同時在美沙酮維持治療過程中更容易產生復吸行為。

尾狀核是獎賞環路中的重要腦區，與殼核共同組成背側紋狀體，是大腦多巴胺通路的主要腦區[21]，在大腦中發揮重要的獎勵及激勵作用。有研究表明，成癮者在藥物線索條件下尾狀核發生了顯著的腦區活改變，并且變化幅度與自我報告的渴求幅度有相關性[22]，尾狀核的獎賞效應是調節控制性和行為性反應的關鍵環節[23-24]。另一研究對不同多巴胺基因型尼古丁成癮患者的研究發現，尾狀核多巴胺的釋放在不同基因型間存在差異[25]，這是因為A+型尾狀核及殼核、伏隔核的DRD2受體密度低于A-型。本研究中A+型成癮者島葉與尾狀核之間的功能連接程度減低，這可能基于A+型尾狀核本身相對減低的DRD2受體數量，削弱了多巴胺獎賞效能的神經活動強度；也可能是A+型成癮者內感受狀態下對獎賞效應的影響及調節發生弱化，使整體的內環境平衡發生改變，獎賞環路對抑制控制、動機驅動及學習記憶環路作用發生紊亂及傾斜，最終更加促進成癮的形成及發展。

本研究的局限性：(1)本研究兩組間左側島葉與全腦功能連接無顯著性差異，這種結果的單側性可能與我們納入的被試均為右利手有關；(2)本研究納入的所有被試均在美沙酮維持治療過程中存在復吸行為，而非復吸的被試被排除，因為有研究表明[26]，治療過程中存在復吸行為和無復吸行為的被試的成癮相關神經機制有顯著的區別，而研究不同DRD2TqIA基因型非復吸與復吸成癮者之間的神經機制差異將是我們下階段試驗的內容。(3)基因型被試量相對較小，且被試均為男性，組間差異的性別易感性不能充分體現。本研究的創新性：首次采用生物遺傳學方法將被試按不同DRD2TqIA基因型分組，將內感受的核心腦區-島葉作為ROI，分析組間大腦功能連接的神經活動差異，依靠rs-fMRI這種可靠技術的橋梁作用，實現基因特征與臨床治療的有效連接，具有研究角度的創新性。

總之，本研究從生物遺傳學這一新角度出發，將美沙酮維持治療的海洛因成癮者按不同DRD2TqIA基因型分組。證明A+型患者在成癮及治療過程右側島葉與雙側背外側前額葉、尾狀核的功能連接均表現出減低；這種由內感受主導的抑制控制功能及獎賞環路的腦區活動模式，可能是DRD2TaqIA基因型調節及影響成癮者神經活動及其美沙酮維持治療效果的重要途徑。而右側島葉-右側背外側前額葉功能連接強度與MMT操守時間表現出正相關，這提示背外側前額葉可能在不同基因型的美沙酮維持治療機制的神經調節中處于重要地位，這為以后對海洛因成癮者按不同DRD2基因型分型治療提供了科學依據和潛在的生物學靶點。

利益沖突：無。