米非司酮單次和多次給藥在Beagle犬體內的藥代動力學研究

郭永，許保海，2，涂鵬程，3，裴開顏*

(1.國家衛生健康委科學技術研究所，北京 100081；2.遵義醫學院細胞生物學教研室，遵義 563003；3.北京協和醫學院，北京 100730)

20世紀90年代以來，以米非司酮為代表的緊急避孕藥物受到越來越多的關注，并在基礎及臨床研究中取得了很大的進步。米非司酮的化學結構與孕酮相似，是一種高效的抗孕激素藥物，可作用于月經周期不同時相，且半衰期較長，研究人員考慮將其用于常規避孕。本課題組曾對米非司酮每周一次口服的臨床效果進行了初步研究[1-2]，研究結果均提示有希望將米非司酮每周一次口服發展為常規避孕方法。體內外研究均表明米非司酮對于治療子宮肌瘤[3-4]、子宮內膜異位癥[5-6]、子宮內膜癌[7]等具有很好的治療作用，但目前適宜劑量和方案尚多在探索之中。因此考慮可以用于特定人群，如子宮肌瘤、子宮內膜異位癥患者，發揮避孕和治療疾病的雙重功效。在進行臨床試驗之前，需要對米非司酮避孕新適應癥進行臨床前研究，評價其安全性和有效性，而有關動物體內米非司酮多次給藥的藥代動力學研究的報道較少，因此本文旨在利用前期已建立并確證的LC-MS/MS定量檢測方法對米非司酮在Beagle(比格)犬體內單次和多次給藥后的藥動學進行研究，為米非司酮作為兼有治療作用的避孕藥物申請臨床研究做準備。

材料和方法

一、動物及材料

1.實驗動物：比格犬，雌性，普通級，8～12 kg，購自北京瑪斯生物技術有限公司，實驗動物生產許可證為SCXK(京)2016-0001。試驗動物檢疫觀察14 d，觀察動物的外觀體征、行為活動、糞便性狀、體重及飲食等指標，發現有病動物及時剔除。動物使用前經動物管理人員和專題負責人檢查認可。

動物房環境條件控制室溫18℃～24℃，相對濕度40%～70%，光照12 h明暗交替。普通飼料為犬維持料，購自北京華阜康生物技術股份有限公司。飲水：飲用純化水，經酸化后自由飲用。

2.儀器：API 4000 Qtrap 液相色譜-質譜聯用儀(Applied BioSystem，美國)，包括：API 4000 Qtrap 三重四極桿質譜、配有ESI源、Analyst 1.5.2 數據處理系統；液相部分為Agilent 1200高效液相色譜，配有G1312A 二元溶劑輸送泵、G1367A 自動進樣器、G1379A 脫氣機、G1316A 柱溫箱。

3.試劑：米非司酮標準物質：純度>99%，批號72801608006(秦皇島紫竹藥業)；甲醇(批號：170237)、甲酸(批號：174477)、乙腈(批號：168772)、DMSO(批號：155977)、甲基叔丁基醚(MTBE，批號：166804)均為色譜純(Fisher Scientific，美國)。

二、研究方法

1.實驗分組：根據給藥次數分為單次給藥組和多次給藥組，單次給藥采用靜脈和灌胃兩種方式給藥。單次靜脈注射1 mg/kg，單次灌胃給藥又分為低、中、高3個劑量組，分別是1、3、10 mg/kg 米非司酮，多次給藥采用口服灌胃法給藥，劑量為10 mg/kg。每組各3只比格犬。

2.給藥方式和血漿樣本采集：(1)單次靜脈給藥：靜脈注射米非司酮1 mg/kg，給藥前及給藥后15、30 min，1、2、4、8、12、24、48、72、96 h采集血漿樣本；(2)單次灌胃給藥：單次灌胃分為低、中、高3個劑量組，分別是1、3、10 mg/kg 米非司酮，給藥前和給藥后15、30 min，1、2、4、8、12、24、48、72、96 h采集血漿樣本；(3)多次灌胃給藥：分別于第1、3、5、7、9、11、13、15 天灌胃10 mg/kg 米非司酮，給藥前、后2 h取血，第15天給藥前及給藥后15、30 min，1、2、4、8、12、24、48、72、96 h取血。

血漿標本采集后EDTA抗凝，根據前期穩定性考察數據結果[8]，24 h以內的血漿保存于-4℃冰箱，24 h以后凍存于-80℃冰箱。

3.米非司酮血漿濃度檢測：采用LC-MS/MS法，具體操作參照本研究前期方法學建立結果[8]。

4.藥代動力學參數的計算：采用Phoenix WinNonlin軟件處理比格犬單次和多次口服米非司酮后的血藥濃度測定數據，采用非房室模型估算藥代動力學參數，繪制藥-時曲線。藥代動力學主要參數包括：血漿生物半衰期(t1/2)、血漿藥物濃度達峰時間(tmax)、血漿藥物谷濃度(C0)、血漿藥物峰濃度(Cmax)、藥-時曲線線下面積(AUC)、表觀分布容積(Vz)、穩態表觀分布容積(Vss)、總體清除率(CL)、平均滯留時間(MRT)、生物利用度(F)。

三、統計學分析

結 果

一、單次給藥比格犬體內米非司酮的藥代動力學研究

單次灌胃1、3、10 mg/kg組比格犬體內米非司酮的藥-時曲線如圖1，其主要藥動學參數如下，1 mg/kg組的t1/2值和MRT與3 mg/kg組和10 mg/kg組相比較，差異具有統計學意義(P<0.05)，3 mg/kg組和10 mg/kg之間差異無統計學意義(P>0.05)；AUClast、AUCInf值的增長比值與給藥劑量不成比例，呈現非線性藥代動力學特征；3組的tmax值相比，差異無統計學意義(P>0.05)(表1)。

圖1 單次給藥比格犬體內米非司酮的藥-時曲線

二、生物利用度

單次靜脈注射1 mg/kg組和灌胃10 mg/kg組比格犬體內米非司酮的藥-時曲線如圖2。單次靜脈給藥主要藥代動力學如下，t1/2為(16.38±0.95)h，C0為(604.59±114.26)ng/ml，AUClast為(577.42±206.74)h·ng·ml-1，AUCInf為(622.72±229.94)h·ng·ml-1，Vz 為(41.64±15.71)L/kg，Vss為(22.31±7.74)L/kg，CL 為(1.78±0.71)ml·min-1·kg-1，MRT為(12.80±1.50)h。生物利用度為52.6%。

三、多次灌胃給予10 mg/kg米非司酮的藥代動力學研究

比格犬隔天一次(第1、3、5、7、9、11、13、15 天)灌胃給予10 mg/kg米非司酮后，用LC-MS/MS法檢測血漿中米非司酮的濃度，繪制出平均血漿藥物濃度-時間曲線(圖3)。米非司酮組的主要藥動學參數如下，t1/2(14.08±1.27)h和(32.96±6.96)h，Cmax為(565.33±41.97)ng/ml和(707.67±134.15)ng/ml，AUClast為(3 251.97±845.10)h·ng·ml-1和(5 190.39±2 231.04)h·ng·ml-1，AUCInf為(3 282.69±846.15)h·ng·ml-1和(5 626.17±2 655.38)h·ng·ml-1，MRT為(14.84±2.92)h和(26.09±8.85)h。單次灌胃10 mg/kg給藥組和多次給藥組的tmax、Cmax、AUClast、AUCInf、MRT等主要藥動學參數相比較，差異無統計學意義(P>0.05)(表1)。多次灌胃給米非司酮10 mg/kg后，分別檢測第1、3、5、7、9、11、13和15 天的0 h和2 h的血藥濃度，結果顯示，比格犬體內的血藥濃度保持穩定(圖3)。

組 別例數t1/2(h)tmax (h)Cmax (ng/ml)單次灌胃1 mg/kg34.83±2.990.50±0.0081.97±5.143 mg/kg318.27±2.45*0.67±0.29122.17±41.2610 mg/kg314.08±1.27*0.50±0.00565.33±41.97多次灌胃10 mg/kg332.96±6.96#1.33±0.58#707.67±134.15組 別例數AUClast(h·ng·ml-1)AUCInf(h·ng·ml-1)MRT (h)F單次灌胃1 mg/kg3191.73±44.05202.69±51.604.19±2.9032.5#3 mg/kg3495.21±156.96*#532.56±162.27*#15.67±2.20*27.6#10 mg/kg33 251.97±845.10*3 282.69±846.15*14.84±2.92*52.6多次灌胃10 mg/kg35 190.39±2 231.045 626.17±2 655.3826.09±8.85NA

注：與單次1 mg/kg組相比較，*P<0.05；與單次10 mg/kg組相比較，#P<0.05

圖2 單次靜脈注射1 mg/kg組和灌胃10 mg/kg組比格犬體內米非司酮的藥-時曲線

圖3 比格犬多次灌胃給予10 mg/kg米非司酮的藥-時曲線圖

討 論

目前報道的生物樣本中米非司酮的分析測定方法主要有HPLC法[9-11]和RIA[12]。這兩種方法試劑價格昂貴、步驟繁瑣；RIA 法因存在放射性污染，且操作較為煩瑣，不宜推廣使用；HPLC雖然測定較為準確，但仍存在標本流動相配置復雜，檢測時間長，最低定量下限較高等問題[13-14]。本研究采用前期優化后的建立的LC-MS/MS法[8]進行比格犬血漿中的米非司酮藥代動力學研究，線性范圍寬(1 000倍)，靈敏度可達1.0 ng/ml，血漿中米非司酮的線性范圍均為1～1 000 ng/ml，樣品回收率高。

單次靜脈給藥后，t1/2(16.38±0.95)h，AUClast為(577.42±206.74) h·ng·ml-1，AUCInf為(622.72±229.94)h·ng·ml-1，CL為(1.78±0.71)ml·min-1·kg-1，MRT為(12.80±1.50)h。另外不同濃度灌胃給藥組結果相比發現，1 mg/kg組的t1/2值和MRT與3 mg/kg組和10 mg/kg組相比較，差異具有統計學意義(P<0.05)，1、3和10 mg/kg單次灌胃給藥后，米非司酮在比格犬體內呈現非線性藥代動力學特征。結果提示，不同濃度米非司酮藥物的吸收速度無明顯差異，但隨著劑量的增加，不存在線性關系。有研究采用RIA法進行口服10 mg/kg米非司酮人藥代動力學的研究，結果顯示Cmax為(1.41±0.31)μmol/L，平均tmax為1 h，t1/2為(19.6±4.55)h[12]，趙恒利等[15]采用LC-MS/MS法測定10 mg米非司酮人藥代動力學的研究結果為Cmax為(476.4±223.1)μmol/L，tmax為(1.04±0.80)h，t1/2為(20.61±6.50)h。本研究與其相比較，結果有些差異，這可能是米非司酮在動物體內代謝非常快，半衰期很短，與人體內藥代動力學研究結果有一定差異[16-17]。

本研究結果顯示，比格犬單次和多次灌胃給予10 mg/ml劑量的米非司酮后，血藥濃度分別在0.5 h和1 h達到峰值，多次給藥后達峰時間稍微延長，這可能是食物的影響，使得藥物的吸收錯后。但單次給藥組和多次給藥組的tmax、Cmax、AUClast、AUCInf、MRT等主要藥動學參數相比較，差異無統計學意義(P>0.05)。另外多次灌胃給米非司酮10 mg/kg后，分別檢測第1、3、5、7、9、11、13、15 天的0 h和2 h的血藥濃度，結果顯示比格犬體內的血藥濃度保持穩定，但t1/2和MRT明顯延長、AUC明顯增加，提示米非司酮在比格犬體內有一定蓄積。結果也提示單次給藥后血藥濃度低于多次給藥后的血藥濃度，我們推測一方面因為尚未達到穩態血藥濃度，另一方面是由于多次灌胃未能像單次給藥禁食過夜，因此口服藥物在胃腸道里，食物對藥物吸收的影響所致。