單基因病遺傳變異自動化分析和解讀研究

曹宗富，喻浴飛，陳翠霞，蔡瑞琨，李乾，羅敏娜，高華方，馬旭*

(1.國家衛生健康委科學技術研究所，北京 100081；2.國家人類遺傳資源中心，北京 102206)

醫學正邁入精準醫學時代。近十幾年來，隨著基因組技術尤其是高通量DNA測序的迅猛發展，為基因組學的發展提供了強有力的工具，使人類對基因組的了解越來越便利，人類對疾病基因組的認識也越來越全面，認識到越來越多的疾病都有其相應的遺傳學基礎或病因。通過這些遺傳學改變能夠對疾病進行診斷、預測疾病的發生風險、藥物應答及不良反應的發生[1-3]。人類基因組學、疾病基因組學、以及藥物基因組學的發展正在引來醫學史的一場巨大變革，帶來全新的預防、診斷和治療模式，并過渡到個性化醫療(personalized medicine)或精準醫學(precision medicine)時代。個性化醫療時代擁有個性化的健康管理模式，可根據不同個體的遺傳背景，預測不同疾病在個體中的發病風險，從而實施個性化的健康管理[4]；通過產前無創篩查來避免大部分染色體異常的胎兒出生，通過新生兒篩查和產前診斷來對嚴重的遺傳性疾病進行干預，并對可能攜帶的人群進行再生育指導[5]；個性化診斷則將根據患者某種疾病相關基因上的變異而進行疾病診斷[6]。

單基因遺傳病是精準醫學的重大方向之一。單基因遺傳病(Monogenic disease)是指由于身體所有細胞中單個基因改變而引起的遺傳病，又稱孟德爾遺傳病(Mendel disease)。它的遺傳方式遵循孟德爾定律，突變既可來自父母，也可源于自身，都有遺傳給下一代的可能。單基因病種類繁多，據估計，有超過10 000種人類疾病是單基因病引起。根據世界衛生組織統計，在全球出生人口中所有單基因遺傳病的總發病率高達1%。單基因遺傳病危害嚴重，可致畸、致殘甚至致死，嚴重影響生存時間和生存質量。單基因病精準醫學首先要實現疾病的精確診斷，鑒定出先證者攜帶的致病性突變，從而對單基因病患者進行針對性的治療和干預，對單基因病家庭進行再生育指導。在精準醫學時代，如果能夠在孕期檢出胎兒是否攜帶引起單基因病的致病基因和突變，則可以進行出生缺陷干預。對部分單基因病，如先天性白內障等，如果在嬰幼兒期通過基因檢測早期檢出，則可以進行早期治療干預，最大可能降低致殘致畸程度。精準醫學是基于遺傳檢測技術的發展而發展起來的，遺傳檢測在單基因病精確診斷的價值也越來越重要，使得基于不同技術平臺的遺傳檢測產品正在被開發并應用。

新一代測序技術(Next-generation sequencing，NGS)在單基因病致病突變研究和醫療實踐中的應用越來越廣泛[7]。近年來，大量的研究證實，全外顯子組測序是開展單基因病相關研究，對單基因病患者進行致病突變鑒定的理想方法之一。然而，在精準醫學應用層面，基于新一代測序數據分析和臨床解讀還存在著很多問題，阻礙著基于新一代測序相關產品和技術的推廣，不利于精準醫學的發展。這些問題包括：一是表型復雜，大部分單基因病表型復雜，同一種單基因病表型異質性強，不同單基因病之間臨床特征相互重疊，給單基因病的診斷帶來了很大的挑戰，需要借助于遺傳學輔助診斷；二是遺傳變異的識別，其分析流程過于復雜，難以為醫療機構人員和其他廣大非生物信息學人員所掌握使用；三是致病突變的鑒定，需耗費大量時間對發現篩選的變異逐個人工審核和確認，效率非常低。為此，我們開發了一套基于云的可視化自動化智能化的單基因病遺傳變異分析解讀系統，以滿足單基因病相關臨床和科研的精準醫學需求，通過www.pgenomics.cn提供免費共享服務。

資料與方法

一、單基因病基因變異參考數據庫的建立

基于ClinVar[8]、OrphaNet[9]、UniProt[10]等公共數據庫、PubMed文獻知識庫和自有數據庫，參考人類表型標準用語(Human Phenotype Ontology，HPO)[11]和中文人類表型標準用語聯盟(China HPO，CHPO)的疾病表型用語、HUGO基因命名委員會(HUGO Gene Nomenclature Committee，HGNC)[12]的基因名稱、人類基因組變異協會 (Human Genome Variation Society，HGVS)[13]的變異命名規則，通過數據庫整合、數據挖掘和文本挖掘技術，結合人工編譯審核，整理整合單基因病表型-基因-變異關系，建立單基因病基因變異參考數據庫。

二、遺傳變異的生物信息學分析

采用Fastqc軟件對測序原始數據進行質量檢查，使用BWA MEM對原始數據與人類參考基因組進行比對，采用picard去除重復序列，參考GATK(Genome Analysis Toolkit)最佳實踐對遺傳變異進行分析和識別[14]，采用VEP(Variant Effect Predictor)對遺傳變異進行注釋[15]，利用Genmod對變異的遺傳模式進行分析。

三、遺傳變異的推薦

根據單基因病基因變異參考數據庫獲取單基因病相關的基因，參考ACMG單基因病變異臨床致病性分級標準對遺傳變異進行分級[16]，根據遺傳變異的變異類型、人群發生頻率、預測的變異功能、臨床顯著性分級、數據庫證據等信息對遺傳變異進行綜合評分，根據評分實現對單基因病檢測樣品或家系中致病性變異的推薦。遺傳變異的評分定義為遺傳變異多種注釋結果的加權評分之和，具體方法為

其中，wi為不同證據的評分權重，si為每個證據的評分。wi默認值為1，可根據情況進行調整。

在突變評分基礎上，對突變所在的基因進行累計評分。對每個基因，以在此基礎上，進行累計評分。基因評分Scoreg的方法如下：

Scoreg=max(Scorev)+weSe+wtSt

其中，Scorev為該基因上所有遺傳變異評分的最大值，作為該基因的基線分值。Se為疾病已知致病基因的評分，we為該項評分的權重。St為該基因突變是否符合單基因病遺傳模式評分，wt為該項評分的權重。we和wt默認值為1，可根據實際情況進行調整。

四、致病變異的再確認

致病變異的人工審核和再確認包括：一是，通過基因組瀏覽器查看致病變異兩側區域的序列比對質量；二是，對致病變異在dbSNP[17]、OMIM[18]、MedGen[19]、OrphaNet、1000基因組、gnomAD、PubMed等公共數據庫和自有數據庫進行循證溯源和確認；三是，通過患者病歷與系統自動化推薦的疾病典型臨床特征進行表型比對。經人工檢查和確認后的致病變異位點可生成打印解讀報告。

結 果

一、單基因病基因變異參考數據庫

在基因水平，參考HPO對疾病表型的標準化命名和HGNC對基因符號的標準化名稱，整合ClinVar、OrphaNet、UniProtKB和PubMed來源的疾病基因關系信息，共包括5 654種單基因病和26 109個基因(圖1)。其中，在兩個及兩個以上數據庫中出現的基因共9 601個，占總基因數目的34.70%。

在變異水平，參考HGVS命名規則，整合了來自ClinVar、UniProtKB和PubMed來源的變異共648 814個(圖2)。其中，在兩個及兩個以上數據庫中出現的變異共67 797個，僅占變異總數目的10.45%。

圖1 參考數據庫整合的26 109個基因在各個數據庫的分布

圖2 參考數據庫整合的682 349個遺傳變異在各個數據庫的分布

二、基于NGS數據的自動化分析和解讀

我們基于云開發了可視化自動化智能化的單基因病遺傳變異分析解讀系統，通過www.pgenomics.cn提供免費共享服務，用戶注冊申請后即可登錄使用。

用戶根據試驗設計，選擇對應的NGS分析流程進行分析。可供選擇的NGS分析流程包括：單樣本外顯子組測序胚系突變分析、基于家系設計的外顯子組測序胚系突變分析、單樣本全基因組測序胚系突變分析、基于家系設計的全基因組測序胚系突變分析。然后導入對應的測序原始數據(fastq文件)，提交分析后即可等待分析結果。待分析完成后，即可查看單基因病測序分析報告，該單基因病家系或患者可能的致病基因和變異將被推薦出來(圖3)。示例為一個常染色體隱性遺傳的Joubert綜合征患者的高通量測序分析結果，根據基因評分和變異評分，自動推薦出CSPP1基因上的兩個不同位置的復合雜合突變，c.1132C>T(p.Arg378Ter)和c.2244_2245del(p.Glu750GlyfsTer30)。

對于推薦的致病變異位點，可進一步使用在線基因組瀏覽器對致病變異的質量進行可視化評估，包括致病變異位點兩側的參考基因組序列復雜度、測序序列比對質量、測序覆蓋度、等位基因頻率、變異在測序序列的位置分布等(圖4)。

圖3 單基因病測序分析致病基因和變異的自動化推薦

圖4 通過基因組瀏覽器查看致病變異質量

對推薦的致病變異，還可以以在線形式進行變異的循證溯源(圖5)。不同數據源提供的證據包括：(1)變異所在基因在OMIM、MedGen、OrphaNet數據庫中的單基因病名稱、臨床特征描述；(2)變異在1000基因組、gnomAD、dbSNP中的頻率，尤其是在東亞人群中的頻率；(3)變異在PubMed中的報道。對以上兩個位點，在東亞人群中的頻率分布為0.000 24和0.000 38，屬于罕見變異位點。其中CSPP1：c.1132C>T在PubMed已經報道[20]，該突變引入終止密碼子，造成CSPP1蛋白的提前終止，為致病性位點；而CSPP1：c.2244_2245del尚無報道。

同時，原始數據文件的質量評估報告、序列比對報告、致病突變列表都自動生成，可逐個查看并下載。突變列表共有三個供下載，分別是：(1)最可能致病的突變；(2)疾病相關致病基因上的所有變異，包括質量不合格的變異位點；(3)全基因組水平的所有變異位點，包括質量不合格的變異位點。最后，用戶可以預覽報告，通過患者病歷與系統自動化推薦的疾病典型臨床特征進行表型比對。在確認致病變異后，用戶可以在線打印檢測報告。

圖5 變異位點的循證溯源

討 論

該研究采用信息學技術，提供了一種自動化的單基因病遺傳變異分析解讀系統，能夠對新一代測序的原始數據進行生物信息學分析，識別檢測樣品中遺傳變異，并根據變異的類型、功能預測結果、人群頻率、人群致病性證據、是否符合遺傳傳遞模式等對變異進行綜合評分和致病性分級，最終鑒定和報告檢測個體中的致病突變。我們研究并開發的系統能夠實現從新一代測序原始數據到致病變異報告的全程自動化，并可通過基因組瀏覽器在線查看致病變異的測序質量，可通過PubMed ID實現對變異相關文獻報道的查證，或對來源于數據庫的證據進行溯源，極大降低了遺傳變異人工解讀的工作量，大大提高了單基因病新一代測序中遺傳變異分析和臨床解讀的效率。

該研究獲得的整合數據庫為單基因病遺傳變異分析及解讀提供了參考數據，其來源包括ClinVar、OrphaNet、UniProtKB和PubMed。這四個數據庫收錄的變異各有不同，互為補充。ClinVar是一個描述人類遺傳變異和表型關系的整合型綜合性數據庫，是一個由用戶驅動的開放型數據庫，允許多個用戶提交數據，相同的變異-表型關系可得到相互驗證。這也使得ClinVar能夠收錄沒有報道過的變異。OrphaNet是專注于罕見病和孤兒藥的參考性數據庫，其目標旨在幫助罕見病患者來改善診斷、照護和治療。OrphaNet僅對基因水平的數據進行公開，而變異水平的數據不能免費獲取。UniProtKB關注于導致氨基酸改變的變異，其數據來源主要是Swiss-Prot、 TrEMBL 和 PIR-PSD 三大數據庫，與其它數據庫的來源不同，可作為ClinVar、OrphaNet等的補充。PubMed數據庫收錄的大多是首次發現的遺傳性疾病相關的基因和變異，并沒有全部被其他公共數據庫收錄。我們沒有整合OMIM數據庫，主要是由于需要每個月獲取序列號，而且限制使用；另一方面，OMIM數據庫也會定期向ClinVar提交數據。

單基因病遺傳變異分析解讀系統實現了對單基因遺傳病患者和受累家系致病基因突變的鑒定，輔助單基因病領域相關的臨床醫生進行遺傳學病因診斷，加快單基因病相關科研人員的研究發現，為單基因病患者的治療、康復和預后提供參考，以及單基因病家庭的再生育指導提供幫助。該系統通過國家人類遺傳資源共享服務平臺，可為我國單基因病領域臨床醫生和科研人員提供免費共享服務。目前，該系統正在面向我國17個省、直轄市或自治區的45家臨床醫療機構和科研院所，為單基因病領域的臨床醫生和研究人員提供單基因病智能化遺傳咨詢共享服務[21-22]。