克羅米酚對(duì)多囊卵巢綜合征患者血清中NO、IL-10及MMP-9的調(diào)節(jié)作用

康曉麗，杜海燕

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，包頭 014010)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是一種非常普遍的生殖內(nèi)分泌紊亂疾病，6%～8%的育齡婦女因此無(wú)法正常受孕[1]。研究表明，15～24歲的年輕女孩患PCOS的比例約為22.5%[2]。無(wú)排卵是PCOS患者中亟需解決的一個(gè)難題，研究認(rèn)為是由微血管功能障礙和慢性炎癥導(dǎo)致的[3]。一氧化氮(NO)是內(nèi)皮細(xì)胞功能正常的標(biāo)志物，通常在卵巢卵泡形成過(guò)程中有所增加，以助于維持妊娠[4]。研究顯示，不孕PCOS婦女中內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙增加了妊娠失敗的幾率[5]。基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)是一種參與細(xì)胞外基質(zhì)降解的蛋白酶，與排卵、胚胎發(fā)育、囊胚植入、器官發(fā)生等重要的生殖生物學(xué)過(guò)程有關(guān)，而這些都是成功妊娠必不可少的。先前的研究已經(jīng)證明PCOS患者血清中MMP-9水平升高，認(rèn)為MMP-9水平升高可能與自發(fā)性妊娠失敗有關(guān)[6]。另外，由于在PCOS中存在促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子之間的不平衡，從而維持了慢性亞臨床低度炎癥狀態(tài)[7]。IL-10是一種抗炎細(xì)胞因子，通過(guò)其多效性作用以及低水平來(lái)維持妊娠，同時(shí)已被證實(shí)在PCOS中的表達(dá)水平較低[8]。克羅米酚(Clomiphene Citrate，CC)作為臨床常用促排卵藥物，常規(guī)用于治療PCOS患者的排卵障礙，研究證實(shí)應(yīng)用CC使PCOS患者的排卵和妊娠率得到顯著改善[9]。由于NO、IL-10和MMP-9與PCOS的致病機(jī)制有著重要的相關(guān)性，本研究希望通過(guò)評(píng)估CC對(duì)PCOS不孕女性血清NO、IL-10和MMP-9水平的影響，來(lái)進(jìn)一步探索PCOS的發(fā)病機(jī)制，從而為治療PCOS提供新的思路。

材料和方法

一、研究對(duì)象

選擇2017年1～12月在內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心就診的141例PCOS患者進(jìn)行研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡20～35歲；(2)確診PCOS的患者，診斷標(biāo)準(zhǔn)采用2003年修訂的鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)[10]。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往有其他不孕癥病史的婦女，如輸卵管因素、男性因素不孕；(2)前6個(gè)月使用口服避孕藥、二甲雙胍、地塞米松或其他輔助治療的患者；(3)患有心血管疾病、甲狀腺疾病、糖尿病、高血壓、腎功能不全、炎癥性疾病或卵巢功能減退的患者。所有患者均簽署知情同意書(shū)。

二、研究方法

1.治療方案：給予患者口服CC，患者于月經(jīng)周期第5～10天，每日口服50 mg CC(上海衡山藥業(yè))用于促排卵治療。

2.樣本采集：治療前和用CC治療4周后分別從患者中獲得5 ml靜脈血樣，兩組采血時(shí)間無(wú)顯著性差異。將血清分離并儲(chǔ)存在-80℃，用于分析NO、IL-10和MMP-9水平。

3.分組：B超監(jiān)測(cè)無(wú)優(yōu)勢(shì)卵泡生長(zhǎng)的患者判定為未排卵組，HCG后48 h后陰道超聲確認(rèn)排卵的患者判定為排卵組。排卵后14 d測(cè)血β-HCG陽(yáng)性且于28 d腹部B超觀察到妊娠囊及胎心搏動(dòng)判定為臨床妊娠的患者為妊娠組，血β-HCG陰性判定為未妊娠組。

4.血清NO、IL-10和MMP-9水平測(cè)定：IL-10、MMP-9試劑盒購(gòu)自墨西哥Raybiotech公司，NO試劑盒購(gòu)自深圳晶美生物工程有限公司。嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)試劑盒檢測(cè)血清中IL-10和血清MMP-9的含量，通過(guò)改良Griess法[11]測(cè)定NO水平。

5.排卵和妊娠判定：患者于月經(jīng)第8～10天起根據(jù)卵泡生長(zhǎng)速度進(jìn)行B超監(jiān)測(cè)，當(dāng)卵泡直徑≥18 mm時(shí)，皮下注射HCG 5 000～10 000 U誘發(fā)排卵。HCG注射日取肘靜脈血測(cè)定LH、E2、P，并記錄當(dāng)日子宮內(nèi)膜厚度、成熟卵泡數(shù)目。注射HCG后24～36 h指導(dǎo)患者同房，48 h后陰道超聲確認(rèn)排卵。所有患者在排卵后給予口服地屈孕酮片(達(dá)芙通，雅培，荷蘭) 10 mg，2次/d。排卵后14 d測(cè)血β-HCG明確是否懷孕，陽(yáng)性者于排卵后28 d腹部B超觀察到妊娠囊及胎心搏動(dòng)判定為臨床妊娠。

三、統(tǒng)計(jì)分析

結(jié) 果

一、一般情況及臨床特征

本研究患者的平均年齡(25.51±2.72)歲，體重指數(shù)(BMI)(26.81±2.53)kg/m2，平均不孕年限(2.68±0.68)年；141例患者中，有118例(83.7%)原發(fā)不孕，23例(16.3%)患有繼發(fā)性不孕；大多數(shù)患者月經(jīng)周期不規(guī)律(122例，86.5%)、超重(90例，63.8%)；59例(41.8%)患者具有多毛癥，37例(26.2%)患者存在痤瘡問(wèn)題(表1)。

二、CC治療對(duì)血清NO、IL-10和MMP-9的影響以及臨床結(jié)局

1.CC治療的總體影響：CC治療后與治療前相比，患者血清中IL-10和NO水平均顯著升高(P<0.05)，MMP-9顯著降低(P<0.05)；治療后，75例患者(53.2%)排卵，29例患者(20.6%)妊娠(表2)。另外，B超結(jié)果顯示，對(duì)比同一患者治療前后，卵泡發(fā)育情況得到顯著改善(圖1)。

組 別例數(shù)NO(mmol/L)IL-10(ng/L)MMP-9(mg/L)排卵臨床妊娠治療前14117.23±4.734.53±2.152 886.92±769.16--治療后14117.56±4.55*7.89±3.62*2 498.51±669.39*75 (53.2)29(20.6)

注：與治療前比較，*P<0.05

圖1 患者口服CC前后周期的不同時(shí)相卵泡發(fā)育情況

2.CC對(duì)不同促排卵結(jié)局患者血清中NO、IL-10和MMP-9的影響：CC治療后與治療前相比，排卵組和未排卵組的IL-10水平均顯著升高(P<0.05)、排卵組MMP-9水平顯著降低(P<0.05)，而NO水平在兩組治療前后均無(wú)顯著性變化(P>0.05)；對(duì)比排卵組和未排卵組，治療前IL-10、MMP-9和NO水平均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，治療后排卵組的MMP-9水平顯著低于未排卵組(P<0.01)，IL-10和NO水平的水平無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表3)。

組 別例數(shù)IL-10(ng/L)NO(mmol/L)MMP-9(mg/L)治療前治療后治療前治療后治療前治療后排卵組 754.24±1.517.25±3.12*15.08±3.8716.37±5.752 799.09±819.282 354.17±623.11*#未排卵組664.82±3.588.12±4.88*18.36±4.5820.15±4.542 663.07±769.032 805.11±589.98*

注：與同組治療前相比，*P<0.05；與未排卵組相比，#P<0.01

3.CC對(duì)不同妊娠結(jié)局患者血清中NO、IL-10和MMP-9的影響：在妊娠組和排卵未妊娠組中，與治療前相比，IL-10均顯著增加(P<0.05)而MMP-9均顯著降低(P<0.01)，NO水平均無(wú)顯著性變化(P>0.05)。對(duì)比妊娠組和未妊娠組，治療前IL-10、MMP-9和NO水平均無(wú)顯著性差異，治療后妊娠組的MMP-9水平顯著低于未妊娠組(P<0.01)，IL-10和NO水平的水平無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表4)。

組 別例數(shù)IL-10(ng/L)NO(mmol/L)MMP-9(mg/L)治療前治療后治療前治療后治療前治療后妊娠組 373.88±2.075.22±3.44*15.85±5.1218.16±3.353 073.37±873.412 351.26±621.34*△未妊娠組383.39±1.588.58±3.25*17.34±3.4816.55±4.242 850.22±734.122 644.52±654.33*

注：與同組治療前相比，*P<0.05；與未妊娠組相比，△P<0.01

討 論

本研究通過(guò)對(duì)PCOS排卵障礙患者進(jìn)行CC誘導(dǎo)排卵治療后檢測(cè)患者血清中MMP-9、IL-10以及NO的水平，結(jié)果顯示，與治療前相比患者血清中IL-10和NO水平顯著增加(P<0.05)，而MMP-9顯著降低(P<0.05)。

據(jù)報(bào)道，MMP-9通過(guò)其對(duì)卵巢組織周期性重建參與PCOS的發(fā)病機(jī)理[12]，PCOS患者中卵泡閉鎖與MMP-9水平的升高有關(guān)[13]。本研究中，PCOS患者用CC治療后血清中MMP-9水平與其治療前水平相比顯著降低，對(duì)比排卵組和未排卵組，治療后MMP-9的水平顯著下降(P<0.01)。驗(yàn)證了與正常婦女低水平的MMP-9相比，PCOS患者的無(wú)排卵與MMP-9水平升高之間存在相關(guān)性[14]。研究表明，NO在女性生殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用，NO可使子宮肌層放松、增加子宮血流量、降低胎兒血管阻力，有利于胎盤和胚胎發(fā)育[15]。PCOS中NO水平的降低破壞了對(duì)其妊娠的保護(hù)作用，導(dǎo)致自然流產(chǎn)和不孕。本研究結(jié)果顯示，接受CC治療后的PCOS患者血清中NO水平顯著升高，可能是由于CC可增加雌二醇水平，從而通過(guò)刺激NO合成酶導(dǎo)致NO水平升高。另外，有研究表明，PCOS患者體內(nèi)存在慢性炎癥狀態(tài)[16]，并且有研究調(diào)查CC對(duì)炎癥標(biāo)志物如C反應(yīng)蛋白的影響，但沒(méi)有關(guān)于CC對(duì)IL-10等抗炎細(xì)胞因子影響的研究。本研究顯示用CC治療后患者血清IL-10水平顯著升高，表明其炎癥狀態(tài)得到改善。

除此以外，當(dāng)患者根據(jù)是否存在排卵進(jìn)行分組時(shí)，排卵組治療前后IL-10水平顯著升高，MMP-9水平顯著降低。盡管NO水平相比有所增加，但差異并不顯著。對(duì)比治療后排卵組和未排卵組，同樣無(wú)顯著性差異。這可能是由于NO水平在卵泡發(fā)育過(guò)程中增加，但排卵后NO水平降低。另?yè)?jù)報(bào)道，IL-10水平的增加可抑制NO的產(chǎn)生[17]。另外，CC治療后，未排卵組的IL-10水平輕度升高，但MMP-9水平和NO水平均無(wú)顯著變化。當(dāng)治療后的排卵組和未排卵組比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)排卵組中MMP-9比未排卵組進(jìn)一步降低(P<0.01)。盡管CC降低MMP-9水平和增加IL-10水平的詳細(xì)工作機(jī)制尚不清楚，但本研究結(jié)果表明CC治療能通過(guò)減少炎癥和降低MMP-9水平來(lái)改善排卵。

當(dāng)妊娠組和未妊娠組比較時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)與治療前相比，治療后兩組中的MMP-9顯著降低、IL-10顯著增加，但是兩組中NO水平均無(wú)顯著性差異。當(dāng)用CC治療后比較兩組之間生化參數(shù)的變化幅度時(shí)，與未妊娠組相比，只有MMP-9的水平顯著降低。MMP-9對(duì)成功的胚胎植入和胎盤形成至關(guān)重要，因?yàn)樗龠M(jìn)胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞在植入和形成胎盤過(guò)程中附著和侵入子宮內(nèi)膜。因此，我們推測(cè)CC治療后MMP-9的減少可能是PCOS患者受孕的有利因素。據(jù)報(bào)道，炎癥減輕有助于胚泡植入和維持母體子宮內(nèi)膜血管功能[18]。在本研究中，排卵組和妊娠組的IL-10升高，提示CC治療后炎癥減輕可能是提高PCOS患者妊娠率的因素之一[19]。據(jù)研究報(bào)道，大約15%～40%的PCOS患者被發(fā)現(xiàn)對(duì)CC耐藥[20]。由于沒(méi)有標(biāo)記可以預(yù)測(cè)PCOS患者的CC抗性，因此需要進(jìn)一步來(lái)研究NO、MMP-9和IL-10水平是否可以用作預(yù)測(cè)PCOS患者CC抗性的標(biāo)記物。如果證明這些標(biāo)記物可以預(yù)測(cè)CC耐藥性，那么臨床醫(yī)師可以根據(jù)它們的水平?jīng)Q定PCOS患者是否應(yīng)該用CC或促性腺激素還是腹腔鏡卵巢鉆孔術(shù)來(lái)治療。

總之，用CC誘導(dǎo)的排卵能增加NO和IL-10的水平，并降低MMP-9的水平，特別在CC治療后的排卵組和妊娠組患者中顯著降低了MMP-9的水平，同時(shí)也提高了PCOS不孕婦女的排卵率和臨床妊娠率。但需要進(jìn)一步的研究來(lái)分析增加劑量的CC對(duì)這些參數(shù)的影響，以及CC改變這些參數(shù)的機(jī)制。