復蘇周期單囊胚移植的胚胎選擇策略

夏夢，董娟，馬龍，曾橋，吳春香，蔡令波，劉金勇，劉嘉茵

(南京醫科大學第一附屬醫院臨床生殖醫學中心，南京醫科大學生殖醫學國家重點實驗室，南京 210029)

輔助生殖技術發展四十年來，隨著臨床促排卵方案的優化和胚胎培養技術的提高，IVF-ET的成功率已顯著升高。為了降低多胎率，提高著床率，囊胚培養和移植技術在臨床上得到越來越多的重視，尤其是單囊胚移植技術的應用越來越廣泛。

胚胎基因組激活是在第3天8細胞期后[1]，胚胎基因組從母體型轉變為胚胎型時才能真正評估胚胎發育潛能。囊胚培養允許胚胎得到自然篩選，可在胚胎基因組激活之后挑選高質量的胚胎。囊胚階段移植，胚胎發育與子宮內膜發育同步，可以提高胚胎種植率及妊娠成功率，從而實現單個囊胚移植，降低多胎妊娠率[2-3]。

隨著商業化培養體系的不斷優化，人類囊胚培養成功率和囊胚質量得到提高[4-5]。囊胚質量可直觀反映胚胎發育潛能，是行單囊胚移植首要考慮的關鍵因素。目前囊胚的形態學評分通常采用Gardner & Schoolscraft評分系統[6]，但在實際單囊胚移植的胚胎選擇時，內細胞團、滋養層細胞二者的評分可能并不平行，選擇內細胞團最佳的囊胚還是選擇滋養細胞層最佳的囊胚進行移植，國內外文獻尚有異議[7-8]。本研究探討復蘇周期中囊胚質量對于單囊胚移植策略選擇的影響，旨在為單囊胚移植提供直接的臨床依據。

資料和方法

一、研究對象

從輔助生殖管理系統(CCRM)數據庫調取2015年1月至2017年12月期間在本院生殖中心完成的囊胚移植復蘇周期共4 668個，回顧性分析各項數據。患者納入標準：(1)女方年齡<40周歲；(2)子宮內膜厚度在7～14 mm之間；(3)囊胚培養凍存的新鮮周期使用常規促排卵方案；(4)復蘇后囊胚擴張且為單個囊胚移植周期。排除標準：(1)新鮮囊胚移植；(2)卵子捐贈囊胚培養凍存周期；(3)囊胚解凍后皺縮狀態移植周期；(4)失訪周期。

二、研究方法

1.促排卵及囊胚培養：所有研究對象采用的超促排卵方案按本中心常規進行，獲卵后根據患者情況采用常規IVF授精或行單精子卵胞漿注射，在受精后的第3天根據胚胎評分情況挑選1～2枚優質胚胎移植或冷凍，剩余胚胎經患者知情同意后進行囊胚培養，第5～6天將發育成囊胚的胚胎進行冷凍保存。擇期行復蘇周期單囊胚移植。本研究4 668例患者均簽署囊胚培養知情同意書及胚胎冷凍協議。

2.囊胚評分方法：本中心囊胚評分采用Gardner & Schoolscraft評分系統[6]。

根據囊腔擴張程度分為1～6個時期。1期：早期有腔囊胚，囊胚腔小于胚胎總體積的1/2；2期：囊胚腔體積大于或等于胚胎總體積的1/2；3期：完全擴張囊胚，囊胚腔完全占據胚胎；4期：囊胚腔完全充滿胚胎，體積大于早期胚胎，透明帶變薄；5期：正在孵出的囊胚，囊胚的一部分開始從透明帶中孵出；6期：孵出囊胚，囊胚全部從透明帶中孵出。

處于3～6期的囊胚，根據內細胞團和滋養外胚層細胞的質量各分為3級。內細胞團分級：A級：細胞數目多，結合緊密；B級：細胞數目少，結合松散；C級：細胞數目很少。滋養層細胞分級：A級：細胞數量多，形成緊密排列的上皮細胞層；B級：細胞數量少，排列松散；C級：極少數的大細胞。本中心僅對4～6期且BC或CB級別以上囊胚進行冷凍，CC級別予以廢棄。

3.囊胚冷凍與復蘇：本中心采用COOK玻璃化冷凍及解凍試劑盒(Cook，K-SIBW-5000，美國)。將囊胚進行人工輔助皺縮囊腔，將囊胚腔液釋放，隨后在37℃熱板下進行冷凍。4.6 ml V2加入0.4 ml DMSO配成冷凍用V2液體(濃度為0.8 mmol/L)，4.2 ml V3加入0.8 ml DMSO配成冷凍用V3液體(濃度為1.6 mmol/L)。將胚胎移入V1液體中1 min，后移入冷凍V2液體中平衡3 min，觀察胚胎皺縮及恢復情況，再移至冷凍V3液體中30 s，并在1 min內裝載并投入液氮內。解凍操作在37℃下進行，胚胎在1 mol/L蔗糖內平衡1 min左右，根據胚胎情況依次移至解凍T1液體5 min，T2液體5 min及T3液體5 min，后移至預先平衡好的囊胚培養液中繼續培養。復蘇后4～6 h在倒置顯微鏡(Nikon，日本)下觀察囊胚恢復情況，經B超引導下行宮腔內胚胎移植術。

4.復蘇周期內膜準備及囊胚移植：患者采用人工周期或自然周期準備子宮內膜。自然周期：用于月經規律，排卵正常的患者。于月經周期第10～12天開始B超監測排卵，排卵前注射HCG(珠海麗珠制藥)5 000 U，監測到排卵后常規黃體支持。人工周期：用于排卵障礙者。于月經周期第2～4天常規B超檢查，口服戊酸雌二醇(補佳樂，先靈，德國)4～6 mg/d，B超監測當內膜厚度≥8 mm時常規黃體支持。黃體支持第5天在B超引導下行胚胎移植，每周期移植1枚復蘇且擴張囊胚，移植后繼續黃體支持。

5.移植妊娠與妊娠結局的判斷：移植后14 d檢測血β-HCG，若為陽性在移植后4周B超檢查，超聲下見原始心管搏動及孕囊判定為臨床妊娠。妊娠12周內胚胎停止發育或發生妊娠物排出則診斷為早期流產。妊娠滿28周且至少有1個存活新生兒分娩定義為活產。隨訪至胎兒出生，并記錄妊娠患者分娩情況及胎兒情況。

三、統計學分析

結 果

一、單囊胚移植妊娠結局

本研究共4 668個復蘇周期，每周期移植1枚囊胚。臨床妊娠率為78.23%，活產率為67.33%，流產率為13.94%。

二、囊胚凍存前發育天數對妊娠結局的影響

D5與D6囊胚移植患者的基本情況分析顯示，兩組年齡、不孕年限、不孕類型、BMI、基礎FSH水平、子宮內膜厚度比較差異均無統計學意義(P>0.05)。但D5囊胚移植臨床妊娠率及活產率均顯著高于D6囊胚移植，且流產率顯著低于D6囊胚移植(P<0.05)(表1)。

三、囊胚腔擴張程度對妊娠結局的影響

重新擴張是囊胚有繼續發育潛力的標志(圖1)。對復蘇后4～6期囊胚移植妊娠結局進行分析，移植前囊胚腔擴張程度與臨床妊娠率及活產率無顯著相關性(P>0.05)(表2)。

四、不同囊胚級別對妊娠結局的影響

4～6期可移植囊胚根據內細胞團和滋養層細胞形態分為AA、AB、BA、BB、BC及CB級別(圖2)。除去囊胚腔擴張程度的影響，各級別囊胚移植妊娠結局比較結果顯示：優質囊胚(包括AA、AB和BA級)均有較高的臨床妊娠率和活產率，整體上優于非優質囊胚(BB、CB、BC)(P<0.05)。AA級別囊胚臨床妊娠率(86.86%)和活產率(78.11%)最高，而流產率(10.08%)最低；相較于AB級別，BA級別臨床妊娠率和活產率較高，而流產率較低(P<0.05)。非優質胚胎中，BB級囊胚臨床妊娠率和活產率均優于BC和CB級囊胚(P<0.05)，而流產率無顯著差異(P>0.05)；BC級別與CB級別囊胚移植臨床妊娠率和活產率無顯著性差異(P>0.05)，但CB級別囊胚流產率顯著降低(P<0.05)(表3)。

組 別周期數平均年齡不孕年限[M(P25,P75)]BMI(kg/m2)基礎FSH(U/L)D5囊胚組3 63029.55±4.093.00(2.00,5.00)22.30±2.877.27±3.16D6囊胚組1 03830.28±4.283.00(2.00,5.00)22.34±5.747.02±3.29組 別周期數內膜厚度(mm)臨床妊娠率活產率流產率D5囊胚組3 6309.41±1.5280.85(2 935/3 630)70.28(2 551/3 630)13.08(384/2 935)D6囊胚組1 0389.17±1.9969.08(717/1 038)*57.03(592/1 038)*17.43(125/717)*

注：與D5囊胚組比較，*P<0.05

圖1 4～6期囊胚鏡下形態(×400)

表2 4～6期囊胚妊娠結局比較(%)

圖2 各個級別囊胚的鏡下形態(×400)

五、內細胞團(ICM)和滋養細胞層細胞(TE)評分對妊娠結局的影響

對4～6期擴張囊胚進一步探討不同級別內細胞團和滋養細胞層細胞分別對臨床妊娠結局的影響。結果顯示，當不考慮滋養層細胞形態，內細胞團級別越高，臨床妊娠率和活產率越高(P<0.05)，而流產率與之未顯示出統計學相關性(P>0.05)；當不考慮內細胞團形態，滋養層細胞級別越高，臨床妊娠率和活產率越高，且流產率越低(均P<0.05)(表4)。

表3 各級別囊胚移植妊娠結局比較(%)

注：與非優質囊胚各組臨床妊娠率及活產率比較，*P<0.05；與AB組比較，#P<0.05；與BB組比較，$P<0.05；與BC組比較，&P<0.05

表4 ICM和TE評分對妊娠結局的影響(%)

注：與ICM-A組比較，*P<0.05；與ICM-B組比較，#P<0.05；與TE-A組比較，ΦP<0.05；與TE-B組比較，ΔP<0.05

討 論

關于復蘇周期囊胚，發育潛能的評估意義重大。本研究結果顯示D5囊胚比D6囊胚在妊娠率和活產率指標方面具有顯著的優勢。內細胞團和滋養細胞層細胞形態均是預測活產率的重要評價指標，尤其對于優質囊胚，滋養細胞層細胞級別高的囊胚流產率明顯降低，在胚胎發育更早期階段為持續妊娠建立基礎。

囊胚階段移植，胚胎的發育與子宮內膜發育同步，可以提高胚胎種植率及妊娠成功率，同時可以減少胚胎移植的數量和減少多胎妊娠的發生。通過淘汰發育潛能不良的胚胎，篩選出更好的移植胚胎。而要實現單胚胎移植特別是單囊胚移植，首先必須要改善培養條件提高囊胚形成率。另一方面是必須要有可靠和簡便的冷凍保存方法，保證剩余胚胎能安全的凍存，以確保患者的累積妊娠率。序貫培養體系的不斷完善顯著提高了囊胚形成率。同時自2000年Yokota等[9]報道了世界首例玻璃化冷凍復融移植獲得妊娠的病例以來，凍融胚胎移植發展迅速。2006年國內報道玻璃化冷凍囊胚的復蘇率達90.4%，臨床妊娠率達73.7%[10]。這兩方面成為單囊胚移植實現的基礎。

掌握預測活產率的評價指標，可為單個囊胚挑選移植提供臨床依據。有研究顯示，D5囊胚復蘇率、種植率及活產率均顯著高于D6囊胚，認為囊胚形成的時期是妊娠結局的重要相關因素。針對小于37歲女性病例的分析發現，相較于D5囊胚移植，D6單囊胚胚胎移植流產率顯著增高(21.7% vs.12.3%)[11]。本研究結果表明，復蘇周期中囊胚形成的發育天數影響妊娠結局，D5囊胚移植的臨床妊娠率和活產率均顯著高于D6囊胚，且D5囊胚移植流產率也較低(P均<0.05)，而兩組患者的平均年齡、不孕年限、BMI、基礎FSH等情況差異均無統計學意義(P>0.05)。D6囊胚在發育上較D5囊胚有所延遲，即使擴張充分、質量較好的D6囊胚由于囊胚細胞數增加，必然會有更多的新陳代謝活動和更大的囊胚腔，這些因素都可能影響玻璃化冷凍復蘇的過程和結果。與D6囊胚相比，冷凍過程似乎對D5囊胚細胞DNA的損傷更少，這可能是D5囊胚質量優于D6囊胚的內在原因之一。有文獻推測D6囊胚延長體外培養時間，非整倍體率更高[12]，從而增加早期流產率，相關機制還有待進一步研究。由此在排除囊胚分期和分級的基礎上，相對于D6囊胚，選擇D5囊胚復蘇移植可顯著優化妊娠結局。

囊胚腔擴張程度、內細胞團和滋養層細胞評分均是預測活產率的重要形態學評價指標[13-15]。有研究顯示，冷凍前囊胚腔擴張程度與臨床妊娠率及活產率相關，每擴張一個等級，活產率較原基礎增高36%；而復蘇后囊胚腔每再擴張多10%體積，活產率較原基礎增高39%[16]。冷凍復蘇后，囊胚再擴張程度顯示生殖發育潛能[17-18]，囊胚重新擴張的時間越早，其發育潛力越好，移植后妊娠幾率越高。本研究為排除復蘇后皺縮或未完全擴張等重新擴張程度相關的干擾因素，病例均采用復蘇后4～6 h內囊胚腔完全擴張的4～6期囊胚進行移植。結果顯示，囊胚擴張程度與臨床妊娠率及活產率無顯著相關性，而流產率有增高趨勢但無統計學意義(P>0.05)。可見對于完全擴張的囊胚，內細胞團和滋養層細胞形態學評分比囊胚分期對于判斷囊胚移植妊娠結局的意義更為重要。

在人類囊胚的發育過程中形成了胚胎的首次細胞分化，分別形成內細胞團和滋養細胞層細胞。內細胞團日后發育為胎兒，滋養層細胞發育為胎盤。在目前采用的Gardner囊胚形態學評分系統中，囊胚腔擴張程度、內細胞團和滋養層細胞均是臨床妊娠結局相關的重要評價指標，且三者評分具有獨立性。已有文獻證實內細胞團的大小和形態對于著床有明顯的預測價值[19-20]，移植內細胞團評分高的囊胚妊娠結局更好；也有相關研究表明，在新鮮囊胚移植周期中，并非內細胞團而是滋養細胞層細胞分級與胚胎種植率和活產率呈正相關[16，21]。

我們對4～6期擴張囊胚進一步探討內細胞團和滋養細胞層細胞作為獨立因素對臨床妊娠結局的影響。結果顯示，隨著內細胞團評分增高臨床妊娠率和活產率也有上升趨勢，但流產率卻無相關變化；而滋養細胞層細胞評分則呈現與活產率和流產率都更為緊密的顯著相關趨勢。因此內細胞團與滋養細胞層細胞都是評價活產率的預測指標。而滋養細胞層細胞對于流產率的提示意義，可能與滋養細胞層細胞在囊胚種植早期階段發揮重要作用相關，如HCG信號調節、透明帶孵出、內膜附著，以及與母源性免疫系統的聯系等[22-23]。

本研究顯示，囊胚擴張程度與妊娠結局并無顯著相關，內細胞團評分與臨床妊娠率和活產率呈顯著相關，而僅有滋養細胞層細胞是活產率相關的獨立預測指標。但復蘇周期單囊胚移植的選擇是綜合了內細胞團和滋養細胞層細胞的雙重評價標準[24-25]。我們的研究結果顯示，對于優質囊胚(AA、AB、BA級別)，AA級別囊胚妊娠結局最佳，BA級別囊胚的臨床妊娠率和活產率都高于AB級別，且流產率較低；同時也驗證了之前TE-A組囊胚活產率高于TE-B組，且流產率低于TE-B組的結果。對于非優質囊胚(BB、BC、CB級別)，BB級別囊胚妊娠結局優于BC和CB級別囊胚，CB級別流產率低于BC級別囊胚，亦驗證了TE-B組囊胚流產率低于TE-C組，但BC級別妊娠率和活產率優于CB級別的結果。值得注意的是，BC組有412例而CB組僅有 136例，樣本量相對較少可能會影響統計學差異性。需要進一步擴大樣本量繼續觀察。

本研究主要運用傳統的形態學評分方法評價胚胎質量，具有一定局限性。近來有文獻表明，其他評估胚胎質量的方法可能會改善輔助生殖的結局[26]。例如目前很多中心開展Time-lapse 實時監測系統，可對胚胎形態學和動力學進行更全面的評估[27-28]。另有研究表明，對滋養細胞層細胞質量的精確評價與囊胚種植潛能及性別篩選顯著相關[29]。形態學和非形態學的評估胚胎質量的方法仍在不斷發展，將對改善輔助生殖的臨床結局起到重要作用。

綜上所述，選擇D5囊胚復蘇移植可顯著優化妊娠結局。對于完全擴張的囊胚，相比囊胚分期，內細胞團和滋養細胞層細胞分級是臨床妊娠率和活產率更為密切的預測指標。本研究進一步證實了滋養細胞層細胞級別高的囊胚流產率低，相較于內細胞團，滋養細胞層細胞在胚胎發育更早期階段為持續妊娠建立基礎。對于優質囊胚而言，滋養細胞層細胞對于囊胚種植潛能的影響具有更加重要的意義。以上研究結果為單囊胚的復蘇移植提供了篩選依據。