果酒中二氧化硫、非酚類和酚類物質抗氧化能力的研究

薄慧杰 張愛華 潘 勇 曾令文

（常州大學城鄉礦山研究院，江蘇常州 213164）

食品添加劑二氧化硫（SO2）是食品和飲料行業中最常用的抗氧化劑之一。SO2在果酒中主要以游離和結合這兩種形式存在，兩者的含量之和為總SO2含量。它具有抗氧化、殺菌和防腐能力。

果酒中含有少量非酚類抗氧化物質，如抗壞血酸、脫氫抗壞血酸和谷胱甘肽等，具有抗氧化作用。抗壞血酸是水果中廣泛存在的主要天然抗氧化成分之一。抗壞血酸極易失去電子和氫離子，形成不穩定的中間體化合物脫氫抗壞血酸，所以果酒中含有少量的脫氫抗壞血酸。谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成，由于半胱氨酸上的巰基為其活性基團，是人體抗氧化系統中極其活躍的抗氧化物質。這些非酚類抗氧化物質通常和酚類化合物一起存在，在果酒中起抗氧化劑作用。

酚類物質是芳香環上連有多個或一個羥基的低分子量有機化合物，種類繁多，根據碳環結構的不同，可將其分為類黃酮和非類黃酮物質。總黃酮是指物質中各類黃酮化合物的總含量。黃酮類化合物中含有柚皮苷和少量野漆樹苷，具有抗菌消炎、增強機體免疫力、提高抗氧化能力、延緩衰老、調節代謝機能等作用。酚類物質對果酒的抗氧化活性以及顏色和口感的影響至關重要。

抗氧化能力（AOC）是影響果酒品質的一個重要因素。果酒的氧化褐變嚴重影響果酒的品質，多酚氧化酶（PPO） 和過氧化物酶（POD） 是引起果酒酶促氧化褐變的關鍵酶。多酚氧化酶是一種含銅氧化酶，可將多酚氧化為醌，醌類物質發生聚合會產生類黑色素。過氧化物酶可促進酚類物質和蛋白質反應產生沉淀。通過添加適量抗氧化劑可以抑制果酒的氧化褐變，提高果酒的品質。通常在釀造過程中添加SO2作為抗氧化劑。

由于果酒中SO2對AOC的作用大小尚未確定，需要區分SO2、非酚類抗氧化物質和酚類物質對果酒總體抗氧化作用的強弱。酚類物質通常對果酒的抗氧化性有增強作用，因此福林酚（FCR）法測定總酚含量可以作為果酒抗氧化性強弱的一個指標。本研究針對這一問題進行一系列測定，最終分別確定它們對果酒總抗氧化作用的大小。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗原料

葡萄酒：葡萄品種，白露莎，產于江蘇句容；藍莓酒：藍莓產于江蘇省溧水；楊梅酒：楊梅產于江蘇省溧陽市日日春莊園；水蜜桃酒：水蜜桃品種為湖景，產于江蘇省無錫市洛社鎮桃源圣境果園基地；宣木瓜酒：宣木瓜產于安徽省宣城市廣德縣四合鄉；火龍果酒：火龍果購于江蘇省常州市凌家塘市場；本研究使用的果酒全部由常州大學中澳果酒研發中心釀造。

參考國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，對6種果酒中總SO2、游離SO2、pH、滴定酸和酒精度進行測定，每個樣品重復測定3次，測定結果見表1。

1.1.2 試驗試劑

無水乙醇，99.7%分析純，常州市潤友商貿有限公司；酒石酸，食品級；偏重亞硫酸鉀（PMS），食品級；福林酚試劑，常州市潤友商貿有限公司；無水碳酸鈉，99.8%分析純，常州市潤友商貿有限公司；乙醛，99.5%，5.0 mol/L，薩恩化學技術有限公司；交聯聚乙烯基吡咯烷酮（PVPP），常州市潤友商貿有限公司。

1.1.3 試驗儀器

PHS-25型數顯pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；722N分光光度計，上海儀分科學儀器有限公司生產；LCMS2020液相色譜-質譜聯用儀，日本島津公司生產。

1.2 試驗方法

1.2.1 SO2的測定方法

原理：SO2的測定方法為氧化法，樣品中SO2通過循環真空泵進入接收瓶，然后H2O2和SO2反應，生成H2SO4，再用NaOH標準溶液中和滴定H2SO4，計算SO2的含量。

游離SO2含量測定：調節流速為1 L/min，移去雙口接收瓶，通過側壁加入10 mL，0.3%的H2O2，3-4滴甲基紅—亞甲基藍混合指示劑，然后滴加0.01 mol/L的NaOH，直至溶液呈現橄欖綠色，并且保持30 s不變色，記下所消耗NaOH體積，計算游離SO2的含量。

結合SO2含量測定：連接好接收瓶，給圓底燒瓶加10 mL、25%的H3PO4、用移液管移取20 mL待測酒液至圓底燒瓶，連接裝置，在真空條件下蒸餾樣品，流量1 L/min，反應15 min，反應結束后取下雙口接收瓶，用0.01 mol/L的NaOH滴定至橄欖綠色，記下所消耗NaOH體積，計算結合SO2的含量。每個樣品重復測定3次。12.2pH值和滴定酸的測定

取燒杯加入適量待測樣品，使其能浸沒電極，用pH計電極插入燒杯樣品中，記錄pH值。利用酸堿中和原理，用NaOH標準滴定溶液滴定樣品中的有機酸，以pH=8.2為電位滴定終點，由NaOH標準滴定溶液體積可以計算出樣品總酸含量。每個樣品重復測定3次。

1.2.3 酒精的測定方法

依據GB5009.225《食品安全國家標準 食品中二氧化硫的測定》測定。

1.2.4 果酒抗氧化活性分析方法

1.2.4.1 抗氧化能力的測定

采用福林酚（FCR）方法來測定果酒的抗氧化能力。將0.5 mL樣品與2.5 mL稀釋10倍的FCR混合并使其反應5 min，向混合物中加入2 mL75 g/L的NaCO3溶液，混勻，在室溫下反應2 h后，測量其在760 nm處的吸光度。使用沒食子酸溶液制備標準曲線，并計算回歸方程。結果表示為沒食子酸當量的毫克數（mgGAE/L）。每個樣品重復測量3次。

1.2.4.2 SO2對果酒的抗氧化增強效應

國家標準中規定葡萄酒中SO2最大使用量為250 mg/L，過量的SO2不僅影響果酒的品質而且會刺激人體消化道黏膜，長期攝入還會對肝臟和腎臟造成損害。將樣品中總SO2含量調整到22 mg/L～224 mg/L范圍內，測定它們在各個水平下的總酚含量。為了測出SO2對果酒抗氧化性的增強效果，在稀釋前用質量濃度為1000 mg/L的乙醛對樣品進行處理，游離SO2與乙醛形成醛橋，使SO2含量減少，測定此時樣品中總酚含量。加入乙醛前后測定的總酚含量差值即為SO2對果酒的抗氧化增強效應。

1.2.4.3 非酚類化合物的抗氧化能力

PVPP分子內含有可形成氫鍵的N、O原子，多酚分子中含有至少一個活性氫，可以與PVPP形成氫鍵。由于PVPP不溶于水，多酚分子就通過氫鍵不斷沉積到PVPP分子鏈上而被除去。參考Bridi的方法使用PVPP對樣品進行3次預處理以除去酚類化合物，將 PVPP（100 mg） 加入 1 mL酒樣中，攪拌30 s，將樣品在室溫下以13000 r/min離心5 min，取上清液0.7 mL加入70 mgPVPP，攪拌均勻并離心，再取上清液0.5 mL加入50 mg PVPP，攪拌均勻并離心。此時用FCR方法測定上清液的總酚含量即可表示為非酚類化合物的抗氧化能力。

1.2.4.4 總黃酮含量的測定

使用Bursac等的方法測量總黃酮含量。將0.5 mL不同質量濃度的兒茶素標準溶液中依次加入2 mL去離子水，0.15 mL5%的NaNO2溶液，混勻靜置5 min，加入0.15 mL 10%的AlCl3溶液，混勻靜置1 min，加入1 mL 1mol/L的NaOH溶液，用去離子水定容至5 mL，混勻。以去離子水為空白對照，在510 nm的波長下測定吸光度，每個標準溶液的測定重復3次。以兒茶素的質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線，并計算回歸方程。取0.5 mL樣品，按標準曲線的制作方法測定樣品的吸光度，根據線性回歸方程計算樣品中總黃酮含量。樣品中總黃酮的含量以當量的兒茶素質量濃度（mgCAE/L） 來表示，每個樣品重復測定3次。

1.2.4.5 非酚類抗氧化劑含量的測定

通過高效液相色譜（HPLC）測量非酚類抗氧化劑的含量。HPLC因其高效、高速且高度靈敏性而受到廣泛應用。采用楊媛、杜梨梨等的方法，用偏磷酸提取酒樣中的抗壞血酸和脫氫抗壞血酸。使用液相色譜-質譜聯用儀，采用C18色譜柱分離，以甲醇-磷酸鹽緩沖溶液（pH 3.5） 為流動相，在245 nm下檢測。同時用HPLC標準曲線法進行酒樣中還原型和氧化型谷胱甘肽含量測定的方法，用IntersilODS-3 C18柱，以庚烷磺酸鈉-磷酸鹽緩沖溶液 （pH 3.0） 和甲醇 （V∶V=90∶10） 為流動相，流速為1.0 mL/min，在210 nm下檢測，用外標法進行定量分析。

1.2.5 統計學分析方法

T檢驗是用于小樣本（樣本容量小于30）的2個平均值差異程度的檢驗方法，它使用T分布理論來推斷差異發生的概率，從而判定2個平均數的差異是否顯著。本研究主要用統計產品與服務解決方案（SPASS） 軟件進行T檢驗來檢測6種水果中SO2、非酚類抗氧化物質和酚類物質對果酒總抗氧化性的作用是否存在顯著差異。

2 結果與討論

本研究使用FCR方法來評估SO2、非酚類抗氧化物質和酚類物質對果酒總體抗氧化性強度的影響。

2.1 不同SO2含量對果酒總抗氧化能力的影響

針對白色果酒和紅色果酒，隨著偏重亞硫酸鉀（PMS）添加量的增加，6種果酒和標準樣品中SO2含量也隨之增加，各種果酒中總SO2含量測定結果見表2。

添加不同含量的PMS于標準樣品和果酒中。由于不同果酒的結合強度不同，所以呈現出不同水平的總SO2含量（表2），但都控制在22 mg/L～224 mg/L范圍內，再使用FCR方法測定不同含量總SO2對不同果酒的抗氧化特性影響，結果如圖1、圖2所示。

圖1 不同總SO2含量下測定不同果酒的總酚含量

圖2 不同總SO2含量下測定紅色果酒的總酚含量

圖1和圖2分別顯示的是白色果酒和紅色果酒在不同總SO2含量下的總酚含量。由圖1、圖2可知，總SO2含量在22 mg/L～224 mg/L范圍時，6種果酒隨著SO2含量的增加，其總酚含量也隨之增加。在白色果酒中，白葡萄酒、水蜜桃酒和宣木瓜酒的線性回歸方程分別為y=1.385x+87.454、R2=0.9754，y=0.5111x+219.43、R2=0.9806，y=0.6976x+1642.8、R2=0.9942。根據其線性回歸方程的截距可推算出在不人為添加SO2情況下，白葡萄酒、水蜜桃酒和宣木瓜酒的總酚含量分別為87.45 mgGAE/L、219.43 mg GAE/L和1642.80 mg GAE/L，當其總SO2含量為200mg/L時，其總酚含量為364.45mgGAE/L、321.65 mgGAE/L和1782.32 mgGAE/L。在紅色果酒中，藍莓酒、楊梅酒和火龍果酒的線性回歸方程分別為 y=5.754x+1164、R2=0.9964，y=0.4766x+966.9、R2=0.9972，y=0.8015x+388.69、R2=0.9926。根據其線性回歸方程的截距可推算出在不人為添加SO2情況下，藍莓酒、楊梅酒和火龍果酒的總酚含量分別為1164.00 mg GAE/L、966.90 mg GAE/L和407.65mgGAE/L。當其總SO2含量為200mg/L時，其總酚含量為2314.80mgGAE/L、1062.22mgGAE/L和548.99 mgGAE/L。由此SO2對果酒抗氧化性的增強效應得到驗證。

表2 不同果酒不同水平下的總SO2含量

2.2 SO2對果酒總抗氧化能力的影響

Somers和Ziemelis指出添加足夠量的乙醛可以完全結合存在的游離SO2以防止總酚含量的增加。向樣品中加入1000 mg/L的乙醛可消除SO2的增強效應。在室溫下加入乙醛反應約30 min后，測定不同總SO2含量下不同果酒的總酚含量，結果如圖3、圖4。

由圖3、圖4可知，在添加乙醛去除游離SO2后，不管是白色果酒還是紅色果酒，其總酚含量都在減少。在白色果酒中，白葡萄酒、水蜜桃酒和宣木瓜酒的線性回歸方程分別為y=0.6997x+109.06、R2=0.9614， y=0.3633x+208.88、 R2=0.9889， y=1.9456x+1016.8、R2=0.9743。根據其線性回歸方程計算出當其總SO2含量為200 mg/L時，其總酚含量分別為249.00 mg GAE/L、281.54 mg GAE/L和1405.92 mg GAE/L，比其加乙醛之前分別降低了32%、12%和21%。在紅色果酒中，藍莓酒、楊梅酒和火龍果酒的線性回歸方程分別為y=2.1412x+1345.7、R2=0.9462，y=1.0533x+349、 R2=0.9616，y=0.6788x+370.99、R2=0.979。根據其線性回歸方程計算出當其總SO2含量為200mg/L時，其總酚含量分別為 1773.94 mg GAE/L、559.66 mg GAE/L和506.75 mg GAE/L，比其加乙醛之前分別降低了23%、47%和8%。因此可以得出游離SO2對果酒的總酚含量有促進作用，由于總酚含量的增加可促進果酒抗氧化能力的增強，所以果酒的抗氧化能力也隨之增強。

圖3 添加乙醛的條件下測定白色果酒的總酚含量

圖4 添加乙醛的條件下測定紅色果酒的總酚含量

2.3 非酚類抗氧化物質在果酒中的含量

抗壞血酸存在于許多水果中，并廣泛用作白葡萄酒的防腐劑，且脫氫抗壞血酸是抗壞血酸氧化產物，其本身就是一種抗氧化劑。谷胱甘肽具有解毒作用，可用于藥物，也可作為功能性食品的基料，在延緩衰老、增強免疫力、抗腫瘤等功能性食品廣泛應用。非酚類抗氧化物質在這6種果酒中的含量如下頁表3所示。

通過HPLC外標法測得的L-抗壞血酸和谷胱甘肽的標準曲線線性回歸方程分別是y=59656x-50359、R2=0.9991和y=345008x-309288、R2=0.9996。由表3可知，這3種非酚類抗氧化物質在不同果酒中含量各不相同，其中谷胱甘肽在這6種果酒中的含量較少，抗壞血酸在果酒中的含量較多且差異比較顯著。在白色果酒中，白葡萄酒的非酚類物質含量最高，而在紅色果酒中，藍莓酒的非酚類物質含量最高。

表3 不同果酒的非酚類抗氧化物質的含量

2.4 非酚類物質對果酒總抗氧化能力的影響

參考Bridi等的方法用交聯聚乙烯吡咯烷酮（PVPP） 將樣品進行3次處理，由于PVPP可吸附酚類化合物，所以通過預先除去酚類物質來實現非酚類化合物對果酒總抗氧化強度的測定。加入PVPP后樣品總酚含量如圖5、圖6所示。

圖5 添加PVPP條件下測定白色果酒中的總酚含量

圖6 添加PVPP條件下測定不同果酒的總酚含量

由圖5、圖6可知，當除去游離SO2和酚類物質后，不管是白色果酒還是紅色果酒，它們的總酚含量都明顯下降。在白色果酒中，白葡萄酒、水蜜桃酒和宣木瓜酒的線性回歸方程分別為y=0.0208x+3.834、R2=0.9911，y=0.0759x+21.136、R2=0.9954，y=0.3154x+118.83、R2=0.9963。根據其線性回歸方程計算出當其總SO2含量為200 mg/L時，其總酚含量為7.99 mg GAE/L、36.32 mg GAE/L和181.83 mg GAE/L，比其加PVPP之前分別降低了97%、87%和87%。在紅色果酒中，藍莓酒、楊梅酒和火龍果酒的線性回歸方程分別為y=0.0425x+13.64、R2=0.9837，y=0.3663x+96.432、R2=0.9908，y=0.7917x+82.078、R2=0.9945。根據其線性回歸方程計算出當其總SO2含量為200 mg/L時，其總酚含量為22.14 mg GAE/L、169.69 mg GAE/L和 240.42 mg.GAE/L，比其加PVPP之前分別降低了99%、70%和53%。由此可證明當去除酚類物質后，果酒的抗氧化能力明顯減弱。

2.5 酚類物質在果酒中的含量

酚類化合物是果酒的主要功能性成分，廣泛存在于水果中。果酒是由這些水果釀造而成，所以果酒中的酚類化合物含量也較豐富。本研究針對6種果酒進行酚類物質的測定，結果見表4。

表4 6種果酒中酚類物質的含量

FCR方法測定沒食子酸的標準曲線方程為y=7.65x+0.0093、R2=0.9985；總黃酮測定中兒茶素的標準曲線方程為y=2.4843x-0.0036，R2=0.9987。由表4可知，紅色果酒中的酚類物質含量比白色果酒中的高，在白色果酒中，宣木瓜的酚類物質含量最高，水蜜桃酒次之，白葡萄酒含量最低。在紅色果酒中藍莓酒的酚類物質含量最高，楊梅酒次之，火龍果最少。

2.6 酚類物質對果酒總抗氧化能力的影響

本研究主要是區分SO2、非酚類抗氧化物質和酚類物質對果酒總體抗氧化作用大小，用FCR方法分別測定不同處理下果酒的抗氧化能力，結果見表5。

表5 FCR方法測得的果酒在不同條件下的抗氧化能力

FCR方法為果酒的抗氧化性研究提供了有效的依據。如果已知特定抗氧化劑的摩爾濃度及其吸光度，可根據其線性回歸方程y=7.65x+0.0093、R2=0.9985計算出對應的總酚含量，從而計算出對總抗氧化能力的相對作用。由表5可知，在白色果酒中，白葡萄酒、水蜜桃酒和宣木瓜酒中SO2的抗氧化性分別占總體抗氧化性的9%、6%和8%，非酚類物質分別占總體抗氧化性的6%、10%和8%，總酚物質的抗氧化性分別占總體抗氧化性的85%、84%和84%。在紅色果酒中，藍莓酒、楊梅酒和火龍果酒中SO2的抗氧化性分別占總體抗氧化性的19%、15%和11%，主要非酚類物質分別占總體抗氧化性的31%、34%和28%，總酚物質的抗氧化性分別占總體抗氧化性的50%、51%和61%。

3 結 論

本研究使用FCR方法確定6種果酒中SO2、非酚類抗氧化物質和酚類物質對總抗氧化作用的大小。在白色果酒中，白葡萄酒、水蜜桃酒和宣木瓜酒中SO2的抗氧化性分別占總體抗氧化性的9%、6%和8%，非酚類物質分別占總體抗氧化性的6%、10%和8%，總酚物質的抗氧化性分別占總體抗氧化性的85%、84%和84%。在紅色果酒中，藍莓酒、楊梅酒和火龍果酒中SO2的抗氧化性分別占總體抗氧化性的19%、15%和11%，主要非酚類物質分別占總體抗氧化性的31%、34%和28%，總酚物質的抗氧化性分別占總體抗氧化性的50%、51%和61%。總酚類物質對紅色果酒的抗氧化能力相對較低，這是由于紅色果酒中非酚類物質含量較高。

試驗結果表明，無論是白色果酒還是紅色果酒，酚類物質的抗氧化作用都大于SO2和非酚類抗氧化物質的作用。在白色果酒中，宣木瓜酒的抗氧化性最強，水蜜桃酒次之，白葡萄酒最弱。在紅色果酒中，藍莓酒的抗氧化性最強，楊梅酒次之，火龍果最弱。