微生物實驗室常用菌種保存方法及臨床意義的探討

彭敏飛 李潔 賀燕婷 次仁央中 裘淼偉 周芳美*

菌種保存是維持微生物菌種生物特性、活性與遺傳特性的技術［1］，基本原理是使菌種的生命活動對能量需求最小，將微生物的代謝限制在最小范圍［2］，且菌種在保存的過程中易受到雜菌的污染、基因突變甚至死亡。菌種保存方法多樣，最理想的方式為真空冷凍干燥法［3］，但需要特殊設備，技術難度大且較昂貴，一般單位難以實現［2，4］。但在日常工作、質控、比對、教學過程中均離不開對菌種的需要［5］，且保存菌種時要針對不同的菌種保存的時間選用不同的保存方法［6］，為了探究微生物實驗室常用菌種的適宜保存方法，為臨床提供準確可靠的檢驗結果。本研究對6種常用的保存方法進行比較，以期為微生物實驗室菌種保存方法的選擇提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌種 由浙江中醫藥大學醫學技術學院醫學檢驗與檢疫實驗教學中心保存。主要有5類：（1）腸桿菌：變形桿菌、大腸埃希菌、痢疾桿菌、甲型副傷寒桿菌、乙型副傷寒桿菌、傷寒桿菌、肺炎克雷伯菌、產氣腸桿菌、摩根摩根菌；（2）葡萄球菌：金黃色葡萄球菌、檸檬色葡萄球菌、白色葡萄球菌；（3）鏈球菌：甲型溶血型鏈球菌、乙型溶血型鏈球菌、肺炎鏈球菌、無乳鏈球菌；（4）不發酵革蘭陰性桿菌：銅綠假單胞菌、不動桿菌、黃桿菌；（5）真菌：白假絲酵母菌、新生隱球菌、近平滑假絲酵母菌。

1.2 試劑 綿羊血；瓊脂粉；液體石蠟；甘油；牛肉浸膏；蛋白胨；血瓊脂培養基，營養瓊脂斜面培養基，固體培養基，脫脂牛奶，甘油肉湯，液體石蠟，均用常規方法配制，滅菌。

1.3 方法 （1）菌種保存方法：22種菌種每種保存方法各保存40份，其中脫脂牛奶低溫凍存法、甘油肉湯法、液體石蠟法3個月、6個月、12個月、18個月復蘇菌種，觀察復蘇情況和生化特征。血瓊脂培養基低溫保存法、固體培養基低溫保存法、營養瓊脂斜面培養基低溫保存法，1個月、2個月、3個月、4個月復蘇菌種，觀察復蘇情況和生化特征。（1）脫脂牛奶低溫凍存法：將新鮮牛奶反復煮沸冷卻脫脂，分裝于無菌凍存管中［7］，每管1.5ml，挑取純化后的新鮮菌苔2環于凍存管中，-80℃保存。（2）甘油肉湯法：用無菌涂布棒將需要保存的新鮮菌洗脫在甘油肉湯中，制成菌懸液，移入1.5ml凍存管中，-80℃保存。（3）液體石蠟法：將液體石蠟進行高壓滅菌之后，將所要保存的細菌菌落用接種環接種到斜面培養基上，37℃培養24h，將無菌液體石蠟加入斜面培養基，高出培養基1cm進行封口，置4℃冰箱保存。（4）血瓊脂培養基低溫保存法：將所要保存的細菌四區劃線接種到配制好的血瓊脂培養基上，37℃培養24h，放入4℃冰箱保存。（5）固體培養基低溫保存法：將所要保存的菌種四區劃線接種到固體培養基上，37℃培養24h，放入4℃冰箱保存。（6）營養瓊脂斜面培養基低溫保存法：將所要保存的菌種用接種針接種在營養瓊脂斜面培養基上，37℃培養24h，放入4℃冰箱保存。（2）細菌的生理生化反應鑒別：本實驗在菌種復蘇后對菌種進行了菌種鑒定。菌種經過分離純化之后，觀察菌落形態，通過菌落形態來確定菌種是否發生污染與變異［8］。同時進行了各種生化反應，記錄實驗結果。

2 結果

2.1 血瓊脂低溫保存法、固體培養基低溫保存法、營養瓊脂斜面培養基低溫保存法 3種方法第4個月細菌存活率下降至＜50%，甚至降為0%，適合菌種短期內保存。血瓊脂低溫保存法腸桿菌、葡萄球菌、非發酵革蘭陰性桿菌、鏈球菌第4個月的存活率分別為50%、40%、40%、20%；固體培養基低溫保存法、營養瓊脂斜面培養基低溫保存法腸桿菌腸桿菌、葡萄球菌、非發酵革蘭陰性桿菌4個月的存活率分別為 10%、20%、0%。具體結果見表1。

2.2 脫脂牛奶低溫凍存法、甘油肉湯法、液體石蠟法 菌種在脫脂牛奶低溫凍存下，18個月后菌種存活率為100%。且菌株生長良好，菌落形態正常，適合菌種超長期保存；甘油肉湯法、液體石蠟法兩種保存方法6個月內菌種存活率均＞70%，適合菌種長期保存。甘油肉湯法：腸桿菌、葡萄球菌、非發酵革蘭陰性桿菌、鏈球菌、真菌6個月的存活率分別為 90%、80%、80%、80%、70%；液體石蠟法腸桿菌、葡萄球菌、非發酵革蘭陰性桿菌6個月的存活率分別為90%、80%、90%。結果見表2。

表1 不同保存方法菌種存活率（%）

表2 不同保存方法菌種存活率（%）

3 討論

臨床微生物實驗室是一個專業性很強的特殊實驗室，為感染性疾病的診斷、抗生素的合理應用及院內感染的監測與防控提供重要的依據。而微生物實驗室在標本檢測之前，培養基的生長試驗、染色液和手工生化反應的質控、細菌鑒定系統、質譜儀的性能驗證等都需要質控菌種進行驗證，確認在控后，方可進行檢測，以確保結果的準確可靠，及時發送報告至臨床科室。質控菌種及部分臨床菌種是作為實驗室常用菌種，且購買成本昂貴，根據質控頻度（每日、每周、每月、年校準）需要選擇不同的方法進行保存，常用菌種是否存活是關系臨床微生物實驗室日常工作是否正常開展的關鍵。

保存菌種不僅要求菌種存活，還要求其生物學性狀、生理特性、抗原性等方面不發生變異，這是保存菌種的重要環節［9］。菌種保存方法多種多樣，在應用過程中，應根據實驗室不同菌種保藏目的，選取恰當的方法［10］。

本實驗中比較了三種低溫保存法保存菌種，隨著保存時間的延長，每種保存方法下的菌種存活率都有所下降。鏈球菌保存選用血瓊脂培養基低溫保存法較好，菌種存活率更高，但容易發生污染，肺炎鏈球菌保存在血瓊脂培養基上則需要2～4d傳代一次；斜面培養基和固體培養基低溫保存法操作步驟較簡便，適合腸桿菌、葡萄球菌和非發酵革蘭陰性桿菌短期內保存。血瓊脂培養基低溫保存法、固體培養基低溫保存法和營養瓊脂斜面培養基低溫保存法適合一般菌種短期內保存，可以隨時傳代，操作方便，不需要其他設備。但是需要頻繁傳代，以確保菌種的存活情況，菌種變異的幾率較大，而且容易受到污染［11］。液體石蠟法的優點是同時考慮了低溫和阻斷氧氣，從兩個方面降低了培養菌種的活性，能夠延長菌種的保存時間［12］；甘油肉湯法和液體石蠟法保存菌種相對較好，保存時間長，而且不用頻繁傳代，易于保持細菌的生理生化特性，受污染的機會也較?。?3］。甘油肉湯法前期準備工作較繁瑣，液體石蠟法操作簡便。脫脂牛奶保存菌種時，雖然前期脫脂牛奶制備工作較繁瑣。但菌種保存的時間較長，易于保持菌種的生理生化特性，不容易發生變異，受污染的機會?。?4］；為開展實驗教學和科研工作使用菌種提供了方便［15］。適合營養要求高且需超長期保存的菌種，如鏈球菌等。

本實驗通過6種菌種保存方法對22種菌種進行保存比較，6種保存方法各有其優缺點。為微生物實驗室選用適宜菌種保存方法提供依據。