馬鈴薯低溫響應的ScmiR390-5p及其靶基因表達與結構分析

謝潔，王明，丁紅映，李青，王萬興，熊興耀，秦玉芝

馬鈴薯低溫響應的及其靶基因表達與結構分析

謝潔1，王明1，丁紅映1，李青1，王萬興2，熊興耀2，秦玉芝1

（1湖南農業大學園藝園林學院，長沙 410128；2中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

【】研究馬鈴薯富含亮氨酸重復序列(leucine-rich repeat receptor-like protein kinase LRR-RLK)類受體蛋白激酶基因受（）調控響應非生物脅迫的機理。通過低溫響應馬鈴薯miRNA測序分析與靶基因預測，發現通過調控1個可能的LRR類受體蛋白激酶基因對低溫做出響應；利用實時熒光定量PCR技術（Quantitative Real-time PCR，RT-qPCR）驗證和響應低溫脅迫的表達情況；利用RLM-5′RACE確定作用于的切割位點；利用PCR技術克隆得到的DNA序列和CDS序列，生物信息學分析的結構和功能；利用RT-qPCR分析/在馬鈴薯各組織中的表達情況及其響應各種非生物脅迫的表達情況。RT-qPCR結果表明，低溫誘導表達，的表達則受到低溫的抑制，和的表達在低溫脅迫下呈負相關性；RLM-5′RACE分析表明，作用于的切割位點是ATTCCT//CCTGAGTT，馬鈴薯/調控模塊在低溫響應中起作用。克隆結果表明的CDS序列長度為2 685 bp，編碼894個氨基酸，DNA序列長度為3 549 bp，含有1個內含子、2個外顯子、3′非編碼區和5′非編碼區，的靶位點位于CDS序列內部（960—981 bp，GGAACTATTCCTCCTGAGTTT）。生物信息學顯示是1個富含亮氨酸重復序列(leucine-richrepeat，LRR)的類受體蛋白激酶基因，編碼的蛋白屬于跨膜分泌蛋白。馬鈴薯組織表達RT-qPCR分析顯示，在葉中的表達量最高，根次之，莖中（地上莖、塊莖和匍匐莖）表達量較低；而的表達情況與相反，其在葉中的表達最低，在莖中表達最高（匍匐莖>塊莖>地上莖）。多種非生物脅迫結果顯示，和表達在NaCl脅迫下呈負相關，受到NaCl脅迫誘導表達。與對照相比，ABA和6-BA處理下表達先下降之后呈波浪小幅回調；6-BA處理下表達持續升高，ABA處理下表達先上升后下降。GA3、PEG和IAA處理8 h時，的表達達到峰值，GA3、PEG和IAA處理都能誘導表達，但其變化趨勢與相關性不強。具備編碼LRR類受體蛋白激酶的核酸、氨基酸序列和結構基礎，是的靶基因；/調控模塊在馬鈴薯組織器官中具備明顯作用；在轉錄后水平通過抑制馬鈴薯的表達對低溫脅迫做出響應，同時，馬鈴薯調控模塊在NaCl和6-BA脅迫響應中起作用，但不對ABA、GA3、IAA和PEG脅迫做出響應，和分別在轉錄水平受到ABA、GA3、IAA和PEG脅迫信號調控。

馬鈴薯；；；實時熒光定量PCR；RLM-5′RACE

0 引言

【研究意義】（）家族是一個古老且高度保守的家族，廣泛參與植物的生長發育、側生器官極性形成、花器官形成及脅迫響應[1]。富含亮氨酸重復受體的蛋白激酶在參與植物抗逆性反應、發育調控及激素的信號轉導等過程中發揮作用[2]。運用分子生物學手段探索脅迫相關基因的表達特征和受（）調控的模式，對將來利用基因工程手段進行耐逆境馬鈴薯品種的選育與改良具有重要的意義。【前人研究進展】miRNA是一種轉錄后調控因子，通過對mRNA進行切割或造成翻譯阻遏來抑制靶標基因的表達[3]，實現對環境脅迫信號的響應[4-6]。研究表明進入RISC后通過“Two-Hit”（兩個的靶向位點）的機制作用在上，誘導產生兩個（靶向基因），這兩個序列相似，都可以作用在上，對靶mRNA進行切割或翻譯抑制使沉默[7]。植物在自然條件下經常受到冷、旱、NaCl、激素、重金屬等多種非生物因素的脅迫，目前，對響應低溫及各種非生物脅迫已有不少研究。木薯在低溫脅迫下的表達量下降[8]，高山冰緣植物高山離子芥中通過調控靶基因的表達對低溫做出響應[9]，在低溫脅迫處理的甜楊幼苗葉片中表達升高，表達情況與在毛果楊受4℃低溫處理后經微陣列分析獲得的表達譜結果極為相似[10]。對煙草進行干旱脅迫和恢復澆水處理研究顯示，在不同干旱條件下出現差異表達[11]，表明可能參與植物的NaCl脅迫響應過程。研究人員通過分析NaCl脅迫下玉米冠根組織的降解組文庫，檢測到的靶標無機焦磷酸酶顯著變化[12]，在高粱[13]、煙草[14]、擬南芥[15]和大麥[16]等植物中都發現無機焦磷酸酶在NaCl脅迫下表達量發生改變，推測能通過調控無機焦磷酸酶的表達參與多種植物的NaCl脅迫響應；大豆研究中發現，還可以通過靶向作用于參與植物的NaCl脅迫響應[17]。激素脅迫同樣影響的表達，BA能顯著促進‘全明星’草莓試管苗中的表達；IAA也能顯著提高其中的表達量[18]。Yoon等[19]研究指出，在高IAA濃度下（10 μmol·L-1或50 μmol·L-1）處理12—24 h，擬南芥的表達水平明顯增加，而在低濃度（10 nmol·L-1）下處理相同時間，表達量沒有顯著差異。重金屬脅迫是馬鈴薯生產過程中的重要影響因素之一，DING等[20]研究發現脅迫下過表達轉基因株系中OsHMA和OsNramp的表達增強，促進了水稻地上部分鎘積累量的增加。而亞麻中能編碼轉錄本，推測通過調控亞麻植物的生長過程在Al脅迫中起作用[22]。本研究中的一個預測靶基因屬富含亮氨酸重復受體的蛋白激酶，該類蛋白激酶是植物應答逆境和防御相關過程的重要酶類。LEE等[23]發現水稻中富含亮氨酸重復受體的蛋白激酶OsRLK1被低溫和NaCl脅迫誘導表達，JUNG等[24]發現辣椒的CALRR1在高NaCl和脫落酸（ABA）等非生物脅迫下表達。【本研究切入點】/調控模塊響應低溫等非生物脅迫的研究目前還未見報道。本研究試圖通過測序、RT-qPCR、克隆、RLM-5′ RACE等分子生物學手段探索馬鈴薯中/調控模塊作用模式。【擬解決的關鍵問題】克隆、解析序列結構與功能，并研究/調控模塊在低溫、NaCl、6-BA、ABA、GA3、IAA和PEG脅迫下的響應情況，同時分析與在馬鈴薯不同組織中的調控關系。

1 材料與方法

1.1 植物材料

馬鈴薯GS393（LZ3.4），由美國威斯康星州馬鈴薯種質庫（http://www.ars-grin. gov/npgs/acc/acc_queries.html）引進的耐寒馬鈴薯材料，耐-4℃低溫，冷馴化后可耐-6℃。GS393組培苗按常規管理（19℃），出苗至莖抽生3—4節用于基因克隆和RLM-5′RACE試驗。

1.2 試驗處理

2016年12月，對60瓶生長期一致的組培苗進行冷馴化（5℃）及霜凍處理（-4℃），常規管理且生長期一致的組培苗作對照。進入冷馴化前所取混合樣為CK；5℃馴化第1、2、3天的混合樣為TLX1（對照為CLX1）；5℃馴化第8、9、10天的混合樣為TLX2（對照為CLX2）；5℃馴化10 d后經-4℃霜凍處理的前1、2、3 h的混合樣為TLH1（對照為CLH1）；5℃馴化10 d后經-4℃霜凍處理的前7、8、9 h的混合樣為TLH2（對照為CLH2）。2016年12月底播種，常規大田管理，于2017年4月分別取根、莖、葉、匍匐莖和塊莖，進行及的各組織特異性表達分析。2017年11月對180瓶生長期一致的馬鈴薯GS393組培苗分別用100 mg?L-1IAA、100 mg?L-1ABA、100 mg?L-16-BA、100 mg?L-1GA3、11.7 g?L-1NaCl和20 g?L-1PEG脅迫處理，用于和的表達分析。以上試驗均設置3次重復，取材后用液氮迅速冷凍，-80℃超低溫冰箱中保存備用。

1.3 引物

利用Primer 5.0設計引物，由上海生工公司合成，其序列見表。

1.4 RNA的提取

總RNA的提取采用天根公司的多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取，的提取采用天根公司的miRcutemiRNA提取分離試劑盒。利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，用德國eppendorf Biospectrometer? basic紫外可見光熒光分光光度計（eppendorf Biospectromete? basic，Germany）檢測核酸的濃度和純度。

1.5 RT-PCR

總RNA的反轉錄采用北京擎科新業生物技術有限公司的金牌逆轉錄試劑盒（GoldenstarTMRT6 cDNA Synthesis Kit），的反轉錄采用天根公司的miRcute增強型miRNAcDNA第一鏈合成試劑盒。

1.6 克隆

利用DNA凝膠回收試劑盒從瓊脂糖凝膠中回收擴增片段，與pEASY?-T5Zero Cloning Vector載體連接，然后轉化至大腸桿菌Trans-T1感受態細胞中，通過藍白斑篩選PCR鑒定陽性克隆。DNA凝膠回收試劑盒購自北京擎科新業生物技術有限公司，pEASY?- T5Zero Cloning Kit載體購自泰思德公司，其他藥品為國產分析純。

1.7 實時熒光定量PCR

的RT-qPCR檢測采用北京擎科新業生物技術有限公司的2×T5 Fast RT-qPCRMix，的RT-qPCR檢測采用天根公司的miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒。使用ABI公司的7500定量PCR儀，96孔板和光學膜完成定量PCR反應。以rRNA基因作為管家基因，清水模板為陰性對照，采用2-△△Ct法計算相對表達量的高低。

1.8 RLM-5′ RACE

5′ RACE參照FirstChoice?RLM-RACE Kit試劑盒的方法進行，相應酶購自promega公司，接頭引物由北京擎科新業生物技術有限公司合成。

1.9 序列測定及分析

測序工作委托北京擎科新業生物技術有限公司進行。利用NCBI （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行BLAST比對和基因編碼區ORF的預測；使用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）對進行結構域預測；使用portparam（http://web.expasy.org/ protparam/）工具分析SCLRRK1的理化性質；使用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對SCLRRK1進行跨膜區分析；使用signalP（http:// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）對SCLRRK1的信號肽進行預測；使用NEBcutter（http://nc2.neb. com/NEBcutter2/index.php）對序列的限制性酶切位點進行分析；使用predictprotein（https:// www.predictprotein.org/）在線軟件分析蛋白SCLRRK1的二級結構；使用SWISS-MODEL（http://www.swissmodel. expasy.org/）在線分析軟件對SCLRRK1建模并獲得三級結構模型。

2 結果

2.1 ScmiR390-5p負調控SCLRRK1并具有響應低溫特性

2.1.1 馬鈴薯轉錄組及miRNA測序分析 采用Illumina HiSeqTM2500測序平臺對樣本進行轉錄組和miRNA高通量測序，以馬鈴薯（PGSC_DM_v4.03）為參考基因組，根據|log2 FC|≥1和FDR≤0.01比較、篩選差異表達基因（Differentially expressed genes，DEGs），與miRBase數據庫進行比對—注釋，將序列與miRBase中該miRNA成熟體序列進行無錯配比對，比對上的序列定義為已知的miRNA。并以此為依據作為miRNA的表達量統計，進行DEGs分析。結果發現，低溫馴化后期（8、9和10 d，圖1-A）106個miRNA上調，11個miRNA下調。其中8個上調miRNA的靶基因表現為顯著下調；3個上調miRNA的靶基因在轉錄組分析中表現為顯著上調；11個下調miRNA的靶基因中有2個在轉錄組分析中表現為顯著上調。進入霜凍處理，與對照材料比較，馴化后的材料霜凍處理早期（前1、2和3 h，圖1-B）65個miRNA上調，238個miRNA下調。其中4個上調miRNA的靶基因在轉錄組分析中表現為顯著下調；6個上調miRNA的靶基因在轉錄組分析中表現為顯著上調。

表1 本研究所用引物序列

A: TLX2-CLX2; B: TLH1-CLH1

2.1.2靶基因預測 采用http://plantgrn. noble.org/psRNATarget/上的方法進行miRNA靶基因預測，并根據轉錄組測序結果分析其差異顯著性與表達趨勢，本研究關注的及其差異顯著的靶基因表達情況見表2。因前期觀察到馴化后期和進入霜凍前期都表現為上調，其預測靶基因（）、和則表現為顯著下調，本研究選定（）作為先期靶向調控基因研究對象，進行基因克隆、靶向關系和脅迫響應分析。

2.1.3 低溫脅迫下與的表達 通過生物信息學預測得到的靶基因（MG763883），RT-qPCR和半定量PCR結果如圖2所示。隨著低溫5℃馴化時間的增加的表達量增加，靶基因的表達持續下降，與未經處理的GS393相比（CK），馴化后期的表達量僅0.05（圖2-B，A為對照）；未經馴化的材料在霜凍（-4℃）脅迫下的表達量持續上升，靶基因的表達下降，但下降幅度沒有馴化脅迫明顯（圖2-C）；馴化材料霜凍處理的表達下降，預測靶基因的表達持續上升，馴化材料霜凍處理后期的表達量達到272（圖2-D）。結果表明，低溫脅迫下與的表達量存在負相關性。

2.1.4 低溫脅迫下可能通過結合的切割位點調控該基因表達 根據預測作用位點兩翼設計兩對引物，采用巢氏PCR擴增目的基因片段，如圖3所示。靶基因擴增出明亮的產物料帶，產物大小為415 bp，與預測結果一致，將上述PCR產物切膠回收直接與T載體連接，篩選鑒定陽性者送公司測序，克隆片段序列與預測結果一致，作用于靶基因的GGAACTATTCCT//CCTGAGTTT片段。與存在靶向關系，證明馬鈴薯低溫脅迫響應中存在調控模塊。

表2 不同處理間ScmiR390-5p及其差異顯著的靶基因表達情況

CK：未做處理樣本取混合樣；TLX1：5℃馴化第1、2、3天的混合樣（對照CLX1）；TLX2：5℃馴化第8、9、10天的混合樣（對照CLX2）；TLH1：5℃馴化10 d后經-4℃霜凍處理的前1、2、3 h的混合樣（對照CLH1）；TLH2：5℃馴化10 d后經-4℃霜凍處理的前7、8、9 h的混合樣（對照CLH2）

圖3 ScmiR390-5p對SCLRRK1剪切位點的RLM–RACE驗證

2.2 馬鈴薯SCLRRK1序列分析

2.2.1 馬鈴薯CDS序列分析 對NCBI的EST數據庫中馬鈴薯EST數據庫進行檢索獲得的序列信息。在CDS序列的兩端設計引物，以馬鈴薯組培苗GS393的cDNA第一鏈為模板進行RT-PCR擴增，得到1條長度約2 685 bp的特異條帶（圖4-A），測序結果表明，該片段長度為2 685 bp，與馬鈴薯相關區段的同源性為99%，的靶序列處于CDS序列內部（960—981 bp，GGAACTA TTCCTCCTGAGTTT）。

2.2.2 馬鈴薯DNA序列分析 以馬鈴薯組培苗GS393的DNA為模板進行PCR擴增，得到1條約3 549 bp的特異條帶（圖4-B）。測序結果表明，該片段長度為3 564 bp，與馬鈴薯相關區段的同源性為95%。

圖4 馬鈴薯SCLLRK1基因擴增結果

2.2.3的結構分析 采用portparam在線軟件對的一級結構進行分析顯示其分子質量約為223 kD，理論等電點pI為4.92，總共包括28 902個原子，分子式為C8300H13915N2687O3542S458。蘇氨酸（Thr）的含量最高，達到32.18%。其不穩定指數為38.9，脂肪指數為28.31，根據Guruprasad方法表明SCLRRK1為穩定蛋白。總的親水性平均系數為0.62，預測該蛋白屬于疏水性蛋白。pedictprotein在線分析SCLRRK1的二級結構顯示其α-螺旋占38.7%，延伸鏈占17.23%，β-折疊占8.28%，無規則卷曲占35.79%。SWISS-MODEL在線對SCLRRK1的三級結構進行分析。SCLRRK1整體呈現大螺旋的結構，主要由α-螺旋和無規則卷曲組成，α-螺旋和無規則卷曲中間有延伸鏈連接，含有少量的β-折疊，這與二級結構的預測結果基本一致。

2.2.4 SCLRRK1的功能域分析 通過在線ProtScale工具預測SCLRRK1的親疏水性，SCLRRK1質氨基酸殘基中氨基酸疏水性最大值為3.494，最小值為-2.526，疏水性氨基酸的數目大于親水性氨基酸的數目，且在540—562位氨基酸（IVLAVIGSGLAVFVCVTVVVLLF）之間含有一個典型的疏水區域，可見SCLRRK1為疏水性蛋白（圖5）。使用TMHMM在線分析軟件對SCLRRK1進行跨膜區分析顯示編碼區序列存在明顯的跨膜結構區域，1—539位氨基酸位于細胞膜表面，540—562位氨基酸之間形成一個典型的跨膜螺旋區，563—694位氨基酸位于細胞內，與該蛋白的疏水性區域分析結果基本一致，表明該蛋白可能是一個與細胞信號傳導有關的膜受體蛋白（圖6）。使用SignalP4.1server對馬鈴薯進行信號肽預測顯示C score表示剪切位點分值（C值），S score表示信號肽分值（S值），Y score表示綜合剪切位點分值（Y值）。的S平均值大于0.5，預測該基因為分泌蛋白且存在信號肽。從圖7中可以明顯看出N端信號肽，剪切點位于25和26位氨基酸之間。

圖5 SCLRRK1親水性/疏水性預測

圖6 SCLRRK1的跨膜區預測

2.2.5 SCLRRK1的氨基酸序列分析 SMART結構域預測，結合氨基酸序列分析（圖8），得知SCLRRK1是一類LRR型富含Ser/Thr/Tyr的蛋白激酶，第2—17個氨基酸和第566—576的氨基酸間含有兩個低復雜度區域，第90—113個氨基酸、第114—137個氨基酸、第138—162個氨基酸、第210—234個氨基酸、第330—354個氨基酸和第426—451個氨基酸間含有6個LRR區域，是富含亮氨酸的重復序列，第540—562個氨基酸間含有一個跨膜結構域，第613—888個氨基酸間含有1個蛋白激酶基因STYKc域。克隆并完成系統分析后在NCBI上進行基因注冊（MG763883），并命名為。

圖7 SCLRRK1的信號肽預測

方框內為低復雜度區域；單下劃線為LRR區域；雙下劃線為跨膜螺旋區；陰影部分為蛋白激酶基因STYKc域；橢圓內是ScmiR390-5p的識別位點

2.3 ScmiR390-5p和SCLRRK1的組織表達特異性

如圖9所示，在葉中的表達量最高，根次之，在塊莖和匍匐莖中的表達量較低；而的表達情況與相反，其在葉中的表達最低，在匍匐莖中的表達最高，塊莖次之。該結果與調控模塊中負調控關系相符。

2.4 馬鈴薯SCLRRK1的部分非生物脅迫響應

與對照相比，ABA和6-BA處理24 h時表達量最低，之后呈波浪小幅回調；6-BA處理8 h，達到表達峰值，之后40 h內維持高位水平，ABA處理36 h表達呈波浪上升到峰值后快速下降；GA3、PEG和IAA處理8 h即表達達到峰值，GA3、PEG和IAA處理都能誘導表達，但其變化趨勢與相關性不強；在NaCl處理8 h時出現表達下降，之后回升（圖10）。NaCl和6-BA脅迫處理的各時間點上，表達趨勢都與相反，分析認為負調控在轉錄后水平對NaCl脅迫做出響應，即馬鈴薯調控模塊在NaCl和6-BA脅迫響應中起作用，而在響應ABA、GA3、IAA和PEG脅迫時，和可能分別受到各自的轉錄水平調控。

圖9 ScmiR390-5p和SCLRRK1在各組織中表達的實時熒光定量分析和半定量分析

3 討論

已有研究表明在植物感受逆境脅迫而做出適應性調整過程中miRNA可以通過調控靶基因的表達來參與植物逆境的調控[25-26]。在逆境脅迫下，植物體內形成非生物脅迫因素、miRNA/靶基因、其他相關miRNA等多方面因素反饋環路網絡[27-28]。/tasiRNA/ ARF在葉等器官的極性發育[29]，特別對植物橫向器官發育及生長時期的轉變[30]等方面有重要調控作用，/TAS3/ARF2/ARF3/ARF4定量控制側根生長的作用模式已經得到證實[31]。響應低溫[8-10]及各種非生物脅迫[15-22]也有不少研究，但在響應非生物脅迫過程中的具體靶向（基因）報導多局限于生物信息預測階段，隨著研究的深入及技術不斷發展，挖掘miRNAs的潛在靶基因及驗證其功能對于闡明miRNAs調控機制意義重大。

圖10 ScmiR390-5p和SCLRRK1在各種非生物脅迫下的實時熒光定量PCR分析

本研究通過對的靶基因進行生物信息學預測獲得一個類酪氨酸型富含亮氨酸重復的類受體蛋白激酶靶蛋白，并通過RLM- 5′RACE驗證了作用于的靶點，序列系統分析表明，主要包括胞內激酶域（cytoplasmic protein kinase domain）、胞外結構域（extracellular domain）和跨膜結構域（transmembran domain）[32]等多種信號識別傳遞途徑中的關鍵組分，它們作為質膜受體能夠感受外界刺激，通過磷酸化作用參與胞內信號傳遞。LRR型類受體蛋白激酶是植物中已知的最大的一類跨膜類受體蛋白激酶，其在植物生長發育激素信號轉導以及脅迫反應中具有重要的調控功能。大部分LRR型類受體蛋白激酶的N-末端有信號肽（signal peptide）和亮氨酸拉基序（leucine zipper motif），胞外域包含多個LRR基序，每個基序都有保守序列lxxlxxlxxlx-lxxnxlvgxip，激酶域靠近C末端[33-38]。LEE等[23]發現水稻LRR類受體蛋白激酶Os-RLK1能夠被低溫誘導表達，余剛等[39]將得到的四翅濱藜LRK基因導入到釀酒酵母中，發現其在低溫等脅迫下的存活率明顯高于對照，表明其具有較好的耐低溫等能力。本研究也發現在馬鈴薯低溫脅迫條件下表達受到抑制，證實LRR型類受體蛋白激酶參與低溫脅迫響應過程。研究同時發現低溫誘導表達，表達與之負相關，即/模塊對低溫做出響應。另外，經過5℃冷馴脅迫處理10 d的馬鈴薯在進行霜凍處理，的表達量升高，與沒進過冷馴化的材料表現出相反的表達模式，推測持續低溫脅迫下/模塊隨著低溫作用時間的延長可能存在反饋調節。進一步分析/模塊的組織特異性，結果發現在葉中的表達量最高，根次之，在塊莖和匍匐莖中的表達量較低；而的表達情況與相反。該結果暗示/模塊也可能參與馬鈴薯器官發育，具體有待進一步深入研究證實。

富含亮氨酸重復的類受體蛋白激酶在其他非生物脅迫反應中也發揮著重要的作用，胞外串聯排列的LRRs基序能夠接受外來的信號，除了激素等小分子化合物以外，它還能接受一些小分子多肽類激素的信號。HONG等[40]從擬南芥植株克隆得到，在干旱或高NaCl脅迫下其表達量明顯增高。本研究還發現負調控，在轉錄后水平對NaCl和6-BA脅迫做出響應，即馬鈴薯調控模塊在NaCl和6-BA脅迫響應中起作用，而在響應ABA、GA3、IAA和PEG脅迫時，和可能分別受到各自的轉錄水平調控。

4 結論

RT-qPCR和半定量PCR表明，在低溫脅迫下，負調控表達，RLM-5′RACE證實調控轉錄的切割位點是ATTCCT//CCTGAGTT。克隆獲得的CDS序列和DNA序列，生物信息學分析表明是一類富含亮氨酸重復受體類蛋白激酶，屬于典型的跨膜疏水性蛋白，存在多個胞外LRR結構域、1個單次跨膜區以及1個胞內激酶結構域。

/調控模塊在馬鈴薯組織器官中具備明顯作用；在轉錄后水平通過抑制馬鈴薯的表達對低溫脅迫做出響應。同時，馬鈴薯調控模塊在NaCl和6-BA脅迫響應中起作用。/調控模塊不對ABA、GA3、IAA和PEG脅迫做出響應，和分別在轉錄水平受到上述信號調控。

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Expression and Structural Analysis ofand Its Target Genes in Potato Response to Low Temperature

XIE Jie1, WANG Ming1, DING HongYing1, LI Qing1, WANG WanXing2, XIONG XingYao2, QIN YuZhi1

（1College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University, Changsha 410128;2Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081）

The study was carried out to investigate the mechanism of potato leucine-rich repeat receptor-like protein kinase (LRR-RLK) receptor protein kinase SCLRRK1 regulated by() in response to abiotic stress.【】 By sequencing and analyzing potato miRNAs in response to low temperature conditions and predicting target genes, we found thatresponded to low temperatures by regulating a potential LRR-like receptor protein kinase gene. The expression levels ofandonwas determined by using RLM-5'RACE. The DNA sequence and CDS sequence ofwere cloned by PCR and the structure and function of SCLRRK1 were predicted by bioinformatics analysis. The expression levels of/【】 The results of RT-qPCR showed that the expression ofwas induced by low temperature, while the expression ofwas inhibited. There was a negative correlation between the expression of ScmiR390-5p and scrrk1 under low temperature stress. The result of RLM-5′RACE indicated that cleavage site ofonwas ATTCCT// CCTGAGTT, and potato/regulatory module was respond to low temperature. The cloning results indicated that the CDS ofwas 2 685 bp in length, encoding 894 amino acids, and the gene sequence was 3 549 bp containing 1 intron, 2 exons, 3' non-coding region and 5' non-coding region.target site was located atCDS (960-981 bp, GGAACTATTCCTCCTGAGTTT). Bioinformatics analysis showed that theencoded a leucine-richrepeat (LRR)-like receptor protein kinase, belonging transmembrane secreted protein. RT-qPCR analysis of potato tissue expression pattern showed that the expression level of thewas highest in the leaves, followed by roots, and relatively lowers in stem (terrestrial stem, tuber and stolon). Differently, the expression level ofwas the lowest in leaves and the highest in stems. The results under various abiotic stresses showed thatthe expression ofandwas negatively correlated, andwas induced by NaCl stress. Compared with the control, the expression ofwas decreased and then increased slightly after treatment with ABA and 6-BA. Thelevel increased continuously under 6-BA treatment, while the expression ofincreased first and then decreased under ABA treatment. The expression ofreached the peak after treatment with GA3, PEG and IAA for 8 h. The expression ofwas induced by GA3, PEG and IAA, but the change trend was not correlated to. 【】had the amino acid sequence and structural basis of nucleic acid to encode LRR-like receptor protein kinase, which was the target gene of;/regulatory module had a significant role in potato tissues;responded to low temperature stress by inhibiting the expression of potatoat the post-transcriptional level, while/regulated module played a role in salt and 6-BA stress response. The/regulatory module did not respond to ABA, GA3, IAA and PEG stress, and theandwere regulated by the above signals at the transcriptional level, respectively.

potato;;;quantitative real-time PCR; RLM-5′RACE

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.13.009

2019-01-03；

2019-05-13

國家自然科學基金（31371683）

謝潔，Tel：0731-84618171；E-mail：358562505@ qq.com。

秦玉芝，Tel：0731-84618171；E-mail：qyuz@163.com

（責任編輯 趙伶俐）