基于基因多態性建立腎功能不全患者華法林穩態劑量的預測模型

劉艷麗，林蓉，馮永剛，許曉麗（.西安交通大學第一附屬醫院藥學部，西安7006；2.西安交通大學醫學部，西安 7006）

腎功能不全是冠心病患者心血管事件發生率和死亡率增加的獨立危險因素[1]，另外腎功能不全患者存在高凝狀態，常需要預防性抗凝治療，然而新型口服抗凝藥物大部分經腎臟排泄，腎功能不全患者易在體內蓄積，增加藥物不良反應，所以華法林仍然是長期抗凝患者的常用藥物[2-3]。2012年改善全球腎病預后組織（KDIGO）臨床實踐指南建議：表現為腎病綜合征的膜性腎病患者，如血漿白蛋白明顯降低并伴有其他血栓危險因素時可口服華法林進行預防性抗凝治療（證據等級2C）[4]，但指南中對腎功能不全患者服用華法林的劑量和抗凝強度等未給出明確的建議。為了解華法林在西安交通大學第一附屬醫院（簡稱我院）腎內科患者中的應用情況，探討腎功能不全患者服用華法林的穩態劑量，為臨床在腎功能不全患者華法林抗凝治療方案上提供依據，筆者通過回顧性分析，對我院腎內科服用華法林的腎功能不全患者進行調研。

由于華法林劑量個體差異大且受多種因素影響，其治療窗窄，劑量過大導致出血風險，劑量不足達不到預防血栓形成的治療目的。除年齡、體質量等影響因素以外，遺傳因素如細胞色素P4502C9（CYP2C9）和維生素K環氧化物還原酶復合體1（VKORC1）基因多態性在華法林穩態劑量的變異中也起到重要的作用[5-6]。另外，就腎功能不全對華法林的穩態劑量是否有影響，國內未見報道。本研究采用多元回歸的方法綜合分析，初步建立了腎功能不全患者華法林穩態劑量的預測模型，以期為臨床腎功能不全患者使用華法林提供用藥參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取我院2016年6月－2018年6月腎內科服用華法林的腎功能不全患者，涉及疾病包括原發性腎小球腎炎、慢性腎盂腎炎、高血壓腎小動脈硬化、糖尿病腎病、繼發性腎小球腎炎、腎小管間質病變、遺傳性腎臟疾病。入選標準：（1）漢族，18周歲以上，（2）國際標準化比值（INR）控制在1.5～3.0且穩態達標。排除標準：（1）使用華法林禁忌；（2）有出血傾向的患者、腫瘤患者、妊娠期患者、甲狀腺功能亢進患者。

1.2 方法

1.2.1 華法林穩態劑量釋義 患者服用華法林2～3 d后開始每日或隔日監測INR值，并根據INR值調整給藥劑量，連續3次的INR值在1.5～3.0之間的華法林劑量，即為華法林的穩態劑量。達穩態劑量后，可每4周監測1次INR值。若需調整華法林劑量，則應重復上述步驟直至INR值再次穩定于控制范圍內。

1.2.2 腎功能不全及分期 腎功能不全是指由多種原因引起的腎小球嚴重破壞，使身體在排泄代謝廢物和調節水電解質、酸堿平衡等方面出現紊亂的臨床綜合征。主要病因有原發性腎小球腎炎、慢性腎盂腎炎、高血壓腎小動脈硬化、糖尿病腎病、繼發性腎小球腎炎、腎小管間質病變、遺傳性腎臟疾病以及長期服用解熱鎮痛劑及接觸重金屬等。近年來，根據國際公認的K/DOQI指南[7]，臨床按照腎小球濾過率（eGFR）的水平將腎功能不全分為5期，1期：eGFR正常或升高[eGFR≥90 mL/（min·1.73 m2）]，2期：eGFR輕度下降[eGFR＝60～90 mL/（min·1.73 m2）]，3期：eGFR中度下降[eGFR＝30～59 mL/（min·1.73 m2）]，4期：eGFR重度下降[eGFR＝15～29 mL/（min·1.73 m2）]，5期：腎衰竭[eGFR＜15 mL/（min·1.73 m2）]。

1.2.3 資料收集 記錄患者的年齡、性別、體質量、身高、體質量指數（BMI）、INR、華法林穩態劑量、CYP2C9＊3（1075A＞C）和VKORC1-1639G＞A基因型、eGFR等。

1.2.4 基因檢測 采用熒光染色原位雜交及染色體核型分析方法，取患者2 mL外周血置于EDTA抗凝管中避免凝血或溶血，檢測CYP2C9＊3（1075A＞C）、VKORC1-1639G＞A基因型。操作主要流程：樣本DNA抽提-加樣聚合酶鏈式反應擴增，然后將帶生物素標記的擴增產物與固定在醛基基片上的CYP2C9＊3（1075A＞C）、VKORC1-1639G＞A基因型檢測探針進行特異雜交反應，使特異性雜交信號呈現出顏色，通過對芯片進行掃描，得到樣品DNA擴增產物與每個基因位點的野生型和突變型探針雜交形成的雜交圖像；經軟件分析該圖像，判斷待檢樣品的基因型。

1.2.5 統計學方法 應用SPSS 20.0統計軟件進行統計分析，所有數據先進行正態性檢驗。對正態分布樣本，計量資料以±s表示，計數資料采用頻數和百分比表示；組間計量資料的比較采用配對資料t檢驗，對非正態分布樣本采用卡方檢驗或Fisher確切概率法，檢驗水準α＝0.05。相關性分析采用Pearson相關性檢驗。遺傳平衡的符合程度采用Hardy-Weinberg平衡檢驗，采用多元線性回歸方法確立華法林劑量預測模型。P＜0.05為差異有統計學意義。

1.2.6 驗證試驗 另按“1.1”項下方法選取25例患者，比較其預測模型劑量與實際穩態劑量的差異。

2 結果

2.1 入選患者的一般情況

共入選患者103例，大部分為腎功能不全的2、3期患者，其一般情況見表1。

表1 患者一般情況Tab 1 General situation of patients

2.2 患者基因型頻率及等位基因分布

入選的103例患者中，CYP2C9＊3（1075A＞C）AA基因型95例（占總數的92.23%），CYP2C9＊3（1075A＞C）AC基因型8例（占總數的7.77%），CYP2C9＊3（1075A＞C）CC基因型0例，Hardy-Weinberg平衡檢驗χ2＝0.995，P＞0.05；VKORC1-1639G＞AAA基因型81例（占總數的78.64%），VKORC1-1639G＞A GA基因型21例（占總數的20.39%），VKORC1-1639G＞A GG基因型1例（占總數的0.97%），Hardy-Weinberg平衡檢驗χ2＝0.853，P＞0.05。以上各基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，提示所選取的研究對象具有群體代表性，具有恒定性。患者基因型頻率及等位基因分布見表2。

表2 患者基因型頻率及等位基因分布Tab 2 Patient genotype frequency and allele distribution

2.3 華法林穩態劑量與基因型的相關性

CYP2C9＊3（1075A＞C）AA基因型患者的華法林平均穩態劑量（3.20±0.88）mg/d高于CYP2C9＊3（1075A＞C）AC基因型患者的華法林平均穩態劑量（2.17±0.13） mg/d，差異有統計學意義（P＜0.05）。VKORC1-1639G＞A AA基因型患者的華法林平均穩態劑量（2.89±0.08）mg/d低于VKORC1-1639G＞A GA基因型患者的華法林平均穩態劑量（4.01±0.17）mg/d（P＜0.05）；由于VKORC1-1639G＞A GG基因型患者只有1例，因此未列入統計。

2.4 華法林穩態劑量與性別的相關性

男性患者的華法林平均穩態劑量（3.16±0.11）mg/d，高于女性患者的華法林平均穩態劑量（3.07±0.13）mg/d，但差異無統計學意義（P＝0.608＞0.05）。

2.5 華法林穩態劑量與年齡、BMI、eGFR的相關性

通過Pearson相關性分析后顯示，年齡與華法林穩態劑量呈負相關，R2＝－0.482，P＝0.000＜0.05；eGFR與華法林穩態劑量呈正相關，R2＝0.498，P＝0.000＜0.05；BMI與華法林穩態劑量無明顯相關性，P＝0.339＞0.05，因此BMI未入選預測模型的因素變量。

2.6 華法林穩態劑量預測模型的建立

本研究對103例腎功能不全患者華法林穩態劑量與性別、年齡、CYP2C9＊3（1075A＞C）、VKORC1-1639G＞A、eGFR等入選因素通過多元線性逐步回歸法，得到最佳回歸方程，多元線性回歸結果見表3，回歸方程匯總模型見表4。

表3 多元線性回歸結果Tab 3 Multiple linear regression results

表4 回歸方程匯總模型及其決定系數Tab 4 Related coefficient summary of the model

表3結果顯示，華法林穩態劑量與年齡、eGFR、VKORC1-1639G＞A、CYP2C9＊3（1075A＞C）有關，性別未進入預測模型。表4結果顯示，華法林穩態劑量的最佳預測模型：華法林穩態劑量＝3.057－0.73*VKORC1-1639G＞A+0.08*腎小球濾過率－0.013*年齡+0.565*CYP2C9＊3（1075A＞C）（VKORC1-1639G＞A：AA＝1，GA＝0，GG＝0；CYP2C9＊3（1075A＞C）：AA＝1，AC＝0；年齡為歲；eGFR單位為mL/（min·1.73 m2）（R2＝0.502）。

2.7 驗證結果

25例驗證患者的預測模型劑量（3.12±0.56）mg/d與實際穩態劑量（3.06±0.93）mg/d差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

腎功能的衡量指標有很多，包括血尿素氮、血肌酐、eGFR等，其中血尿素氮受諸多因素影響，如蛋白質攝入量、發熱及消化道出血等，所以血尿素氮不能單獨作為衡量腎功能受損輕重的指標；血肌酐雖然比較穩定，但老年人、肌肉萎縮者的血肌酐水平偏低，不能很好地反映腎功能受損的程度，也不能單獨作為衡量腎功能受損輕重的指標；近年來根據國際公認的K/DOQI指南[7]，臨床按照eGFR的水平作為腎功能不全分期的指標，將腎功能不全分為5期。

腎功能不全患者伴血漿白蛋白明顯降低并伴有其他血栓危險因素時需預防性抗凝治療[8]。然而新型口服抗凝藥物存在價格昂貴、不適用于腎功能不全等患者、無特異性拮抗藥等問題，故華法林仍然是目前長期抗凝患者的常用藥物[9-10]。華法林在體內主要通過CYP2C9代謝，該酶主要由CYP2C9基因編碼，其中CYP2C9＊3是影響華法林代謝最主要突變型；VKORC1是催化氧化型維生素K向還原型維生素K轉化的關鍵酶。國內外學者根據影響華法林的因素陸續建立各種華法林穩態劑量預測模型[11-12]。

本研究根據腎功能不全患者的臨床特點和影響華法林使用劑量的因素，建立了華法林穩態劑量預測模型。在各因素中，BMI與華法林穩態劑量無明顯相關性（P＝0.339＞0.05），因此BMI未入選預測模型的因素變量；年齡與華法林穩態劑量呈負相關（R2＝－0.482，P＝0.000＜0.05）；eGFR與華法林穩態劑量呈正相關（R2＝0.498，P＝0.000＜0.05），與Ichihara N等[13]學者研究結果一致，基因多態性與華法林穩態劑量的相關性結果顯示，CYP2C9＊3（1075A＞C）AA基因型患者華法林平均穩態劑量（3.20±0.88）mg/d顯著高于CYP2C9＊3（1075A＞C）AC基因型患者華法林平均穩態劑量（2.17±0.13） mg/d，VKORC1-1639AA基因型患者華法林平均穩態劑量（2.89±0.08）mg/d顯著低于VKORC1-1639GA基因型患者華法林平均穩態劑量（4.01±0.17）mg/d，與管文燕等學者[13]研究結果一致；性別對華法林穩態劑量的相關性結果顯示，男性患者華法林穩態劑量（3.16±0.11）mg/d高于女性患者華法林穩態劑量（3.07±0.13）mg/d，但差異無統計學意義。綜上所述，華法林穩態劑量的預測模型納入了患者的年齡、eGFR、VKORC1-1639G＞A和CYP2C9＊3（1075A＞C）。通過驗證試驗結果發現，該預測模型計算的預測劑量與實際穩態劑量無明顯差異，對腎功能不全患者華法林抗凝治療有一定指導作用。但本研究入選的患者大部分為腎功能不全的2、3期患者，所以該預測模型對腎功能不全的4、5期患者華法林穩態劑量的預測有待進一步商榷。本研究未分析不同年齡段以及不同腎病分期華法林穩態劑量的差異，樣本量較少，后期還需進一步擴大樣本量，并進行多中心研究。由于收集到驗證數據較少，后期將增加患者進一步驗證該模型，并分析不同年齡段以及不同腎病分期華法林穩態劑量的差異，使建立的模型更加精確，為臨床在腎功能不全患者華法林抗凝治療方案的選擇上提供科學依據。