石仙桃藥材HPLC指紋圖譜的建立及聚類分析Δ

張 淼，陳 龍，朱 華，黎 理，笪舫芳，龍 莉，何瑞婷（廣西中醫藥大學壯瑤藥重點實驗室，南寧530200）

石仙桃（Pholidota chinensisLindl.）為蘭科石仙桃屬植物石仙桃假的鱗莖或全草，又名石橄欖、石萸肉等[1]，具有養陰、清肺、利濕、消瘀的作用，可用于治療眩暈、頭痛、咳嗽、吐血、夢遺等疾病，民間常用其治療高血壓及其他原因引起的頭痛[2-3]。現代藥理研究表明，石仙桃具有鎮靜、抗氧化、抗癌等活性，并對神經系統有抑制作用[4-5]，如以其提取物制成的頭痛定糖漿可治療神經性頭痛[6]。石仙桃作為常用壯藥之一[7]，主要分布于廣東、廣西、福建等地，其中以在廣西應用較為廣泛。目前，市場上石仙桃藥材的品種混亂，導致其質量參差不齊。本課題組前期對石仙桃進行了生藥學鑒別[8]及天麻素、多糖等的含量測定研究。在此基礎上，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）對來自不同產地的16批石仙桃藥材展開指紋圖譜研究，并進行聚類分析，為其質量評價及進一步開發利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

e2695型HPLC儀、2489型紫外檢測器（美國Waters公司）；Agilent 1100型HPLC儀、G1315B型二級管陣列（DAD）檢測器（美國Agilent公司）；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；SQP型萬分之一電子天平[賽多利科學儀器（北京）有限公司]；HH-S6型數顯恒溫水浴鍋（金壇市醫療儀器廠）；H21-HST2106型紅外爐[美的（廣東）集團]；Milli-QAdvantage型A10純水儀（美國密理博有限責任公司）。

1.2 藥品與試劑

16批石仙桃藥材采自廣西、廣東及福建等地，樣品原植物采集后經廣西中醫藥大學藥用植物園高級園藝師朱意麟鑒定為蘭科石仙桃屬植物石仙桃（P.chinensisLindl.）的全草，采集到的藥材水焯5 min，45℃烘干，切段干燥，打粉過2號篩，備用；天麻素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-201409，純度：91.9%）；甲醇（分析純）、乙醇（分析純）、磷酸（色譜純）、醋酸（色譜純）均購自國藥集團化學試劑有限公司；乙腈、甲醇（美國Fisher公司，色譜純）；水為超純水。藥材來源信息見表1。

表1 石仙桃藥材來源信息Tab 1 Source information of P.chinensis

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent SB-aq（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B），梯度洗脫；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：5 μL。梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution procedure

2.2 溶液制備

2.2.1 天麻素對照品儲備液 精密稱取天麻素對照品6.12 mg，加水定容至25 mL量瓶中，即得。

2.2.2 供試品溶液 取16批藥材粉末（過二號篩）0.1 g，精密稱定，置于50 mL錐形瓶中，加入甲醇30 mL，稱質量，回流提取30 min，再次稱質量并補足質量，濾過，取續濾液1 mL至1.5 mL離心管中，以13 000 r/min離心10 min，吸取上清液，備用。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗 取“2.2”項下天麻素對照品貯備液及供試品（編號S2）溶液，以甲醇為空白溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。結果顯示，天麻素的保留時間為7.554 min，與相鄰峰間分離度大于1.5，理論板數不低于5 000，且空白溶液不干擾檢測，結果見圖1。

圖1 專屬性試驗考察結果Fig 1 Results of specificity tests

2.3.2 精密度試驗 取供試品（編號S2）溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，以天麻素峰為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，11個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復性試驗 精密稱取同一批藥材（編號S2）適量，共6份，分別按“2.2.2”項下方法制備成供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以天麻素峰為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，11個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.3.4 穩定性試驗 取供試品（編號S2）溶液，分別于室溫下放置0、1、2、4、8、12、24 h后，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以天麻素峰為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，11個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%（n＝7），表明供試品溶液室溫條件下放置24 h穩定。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成與相似度、共有峰的相關分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 取16批藥材樣品各0.1 g，精密稱定，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，將所得數據導入“中藥指紋圖譜相似性評價系統”（2012）版軟件分析，采用中位數法對相關參數進行自動匹配，標定出藥材的11個共有峰，系統根據藥材共有模式生成石仙桃藥材的對照指紋圖譜R，并生成16批藥材的指紋圖譜。對照指紋圖譜R見圖2，16批藥材HPLC指紋圖譜共有模式見圖3。

圖2 藥材樣品HPLC對照指紋圖譜RFig 2 HPLC control fingerprint R of medicinal samples

圖3 16批藥材樣品HPLC指紋圖譜共有模式Fig 3 Common pattern of HPLC fingerprints for 16 batches of medicinal samples

2.4.2 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012版）分析軟件，以樣品S4的HPLC圖譜為對照，進行整體相似度評價。結果顯示，16批藥材樣品相似度均大于0.9，表明藥材樣品批間差異較小，質量穩定性良好，結果見表3。

表3 16批石仙桃藥材指紋圖譜相似度評價結果Tab 3 Evaluation results of fingerprint similarity of 16 batches of P.chinensis

2.4.3 共有峰的指認及相關分析 16批藥材樣品有11個共有峰，通過與對照品比對，指認1號峰為天麻素，由于其分離良好、峰面積較大，且為所有藥材樣品共有，故設定其為參照峰（S），計算其他峰相對于11號峰的相對保留時間、相對峰面積，結果見表4、表5。

2.5 聚類分析

以16批藥材樣品11個共有峰的相對峰面積為原始數據，應用SPSS 22.0軟件，采用組間平均數聯結法進行聚類分析[9-10]。結果顯示，16批藥材樣品可聚為兩大類：S5、S16、S15、S9、S10、S8、S12、S1、S6、S4聚為一類；S2、S7、S14、S13、S3、S11聚為一類。16批石仙桃藥材的聚類分析圖見圖4。

3 討論

近年來，隨著人們健康意識的增強，利用中藥進行疾病預防和保健的需求逐年增高。藥材質量成為健康市場關注的焦點，尋找有效的中藥質量控制方法成為保證藥材質量的最有效途徑。中藥指紋圖譜法利用其能夠顯示藥材多種成分含量，并能特征性地表達中藥成分復雜性的特殊優勢成為當前最有效、最快捷的常用中藥質量控制與評價方法。鑒于此，本課題組從整體角度出發，采用HPLC指紋圖譜方法分析石仙桃藥材所含的多種化學物質，為石仙桃藥材質量控制與評價提供了實驗基礎和參考依據。

構建指紋圖譜需要樣品具有多個分離度較好的色譜峰，因而樣品的制備就顯得尤為重要。中藥含有多種化學成分，選用不同提取方法提取出來的成分種類或含量就會有所差異，尤其在微量成分方面，因而也會影響到后期指紋圖譜的構建。筆者通過前期文獻研究，初步考察了供試品制備過程中的提取方法（超聲提取和加熱回流），提取溶劑（水、甲醇、乙醇），溶劑用量（20、30、40 mL）以及提取時間（15、30、45 min）等因素，以HPLC指紋圖譜所含共有峰的種類、分離度、峰面積總和等作為評價指標，最終確定了石仙桃供試品制備的最佳提取工藝：藥材粗粉0.1 g，加入甲醇30 mL，加熱回流提取30 min。

表4 16批石仙桃藥材共有峰的相對保留時間Tab 4 Relative retention time of common peak of 16 batches of P.chinensis

表5 16批石仙桃藥材共有峰的相對峰面積Tab 5 Relative peak area of common peak of 16 batches of P.chinensis

圖4 16批石仙桃藥材的聚類分析圖Fig 4 Cluster analysis of 16 batches of P.chinensis

前期，筆者分別考察了不同色譜柱[Agilent ZORBAX SB-aq（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]，不同的流動相系統（乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.05%磷酸水溶液、甲醇-0.05%磷酸水溶液、乙腈-0.05%醋酸水溶液、甲醇-0.05%醋酸水溶液），不同柱溫（20、25、30、35 ℃），不同進樣量（5、10、15 μL）以及不同流速（0.8、1.0、1.3 mL/min）等色譜條件，最終確定了石仙桃指紋圖譜的色譜柱為Agilent SB-aq(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.05%磷酸水溶液，進樣量為5 μL，柱溫為25 ℃，流速為1.0 mL/min。

聚類分析作為一種劃分未知類別的分析方法，常用于中藥品種和質量分析研究中。但其作為常用的探索性分析，在分類的過程中，采用構建方法不同、選取的參照標準不同、樣本數據不同，分類的結果和結論也會不同。由于樣本量的限制及變量類型等不同，本研究采用系統聚類法對16批次石仙桃藥材指紋圖譜進行了聚類分析，并將其聚為兩大類：S2、S7、S14、S13、S3、S11聚為一類，另外幾批藥材聚為一類。其聚類結果與藥材假鱗莖的大小及藥材的生長年限存在一定的關聯度，S2、S7、S14、S13、S3、S11幾個批次藥材假鱗莖較大，生長年限長，也可能是由于藥材的產地、采收季節[11-12]等原因造成了其差異較大。