放線菌KN37菌株代謝物對番茄灰霉病的防治

邵勝楠，張安琪，巴爾那·庫馬爾，張國強

(石河子大學 農學院 / 新疆綠洲農業病蟲害治理與植保資源利用重點實驗室，新疆 石河子832003)

番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)引起的一種重要的世界性番茄病害，該病害主要危害果實，造成果實腐爛，也可危害葉、莖和花，造成嚴重減產，產量損失高達20%～50%[1]。番茄灰霉病可通過氣流、雨水、昆蟲等方式進行多次侵染，而且發病后傳播速度很快，對保護地番茄生產威脅極大。該病害已在全國各地普遍發生，且呈上升趨勢，已成為番茄設施栽培的主要危害因素[2]。目前，防治番茄灰霉病以化學農藥為主，如代森錳鋅、嘧霉胺、異菌脲、腐霉利等。這些藥劑長時間、大劑量地使用，對環境和食品安全產生了大量負面影響，同時還產生了嚴重的抗藥性[3-4]。微生物的代謝產物是一個巨大的天然產物資源庫，從中篩選新農用活性物質是一條相對便捷的道路[5]。而且微生物源農藥相對于化學農藥具有低成本、高活性、低毒、環保等特點，因此以微生物天然產物為基礎，開發新型微生物源農藥，可有效解決番茄灰霉病的危害。因此，本課題組深入挖掘了新疆高寒地區的放線菌資源，從中發現了具有較好抑菌活性的放線菌KN37。本研究主要對放線菌KN37菌株代謝物的抑菌譜進行了廣泛測定，同時利用離體法和活體法系統研究了菌株代謝物對番茄灰霉病的防治效果，旨在為KN37菌株的進一步研究與開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試放線菌放線菌KN37，分離自新疆喀納斯地區，保存于石河子大學農學院植保系農藥實驗室。

1.2 供試病原菌番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、番茄細菌性斑點病菌(Pseudomonassyringae)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、黃瓜黃萎病菌(Verticilliumdahliae)、稻瘟病菌(Phyriculariagrisea)、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、立枯病菌(Alterariaalternata)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、白菜黑斑病菌(Alternariasolani)、玉米小斑病菌(Helminthosporiummaydis)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、葡萄白腐病菌(Coniothyriumdiplodiella)均由石河子大學農學院植保系病理實驗室提供。

1.3 供試培養基高氏1號培養基：KNO31 g，K2HPO40.5 g，NaCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，可溶性淀粉20 g，瓊脂20 g，蒸溜水1 000 mL，pH 7.2～7.4。PDA培養基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸饋水1 000 mL。

1.4 發酵液的制備用打孔器取直徑4 mm的菌餅6個，置于配好的高氏一號液體培養基中掁蕩培養。搖床培養溫度為28 ℃，轉速為120 r·min-1，培養7～10 d。發酵液經6 000 r·min-1離心30 min后，取上清待用。

1.5 發酵液提取物的制備噴霧干燥器對菌株發酵液進行濃縮，對干粉進行復溶和過濾后用大孔吸附樹脂AB-8進行分離，用25%乙醇/水進行洗脫，將洗脫液濃縮后用乙酸乙酯進行液液萃取，然后將乙酸乙酯相濃縮后得到菌株發酵液的提取物。

1.6 抑菌活性測定方法(1)菌絲生長速率法：將PDA培養基與發酵液或提取物按9∶1混合均勻，制成培養基平板，分別從供試病原菌的菌落邊緣，用打孔器切成直徑為4 mm的菌餅，分別放置于培養基中央，使菌餅帶菌絲的一面貼在培養基表面，空白對照不加放線菌KN37發酵液，每個處理重復3次。置于28 ℃恒溫箱中培養72～96 h后，用“十”字交叉法測量供試病原真菌菌落生長直徑，計算菌絲生長抑制率[6]。菌絲生長抑制率=(對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑)/(對照菌落生長直徑-菌柄直徑)×100%。(2)孢子萌發法：取供試病原菌孢子配成106CFU·mL-1懸浮液，在低倍鏡下的每個視野里有30～40個孢子，將發酵液或提取物與供試菌株的孢子懸浮液1∶1混合，每處理重復3次，在28 ℃下培養12 h后觀察計算孢子萌發率以及抑制率[7]。孢子萌發率/%=萌發孢子數/孢子總數×100%；孢子萌發抑制率/%=(對照孢子萌發率-處理孢子萌發率)/對照孢子萌發率×100%。(3)活體組織法：采摘大小均一、健康新鮮的番茄果實。表面用0.1% NaClO溶液消毒晾干后，接種番茄灰霉病菌菌餅；保護作用測定方法為將發酵液提取物(400 mg·L-1)噴施于番茄果實表面，22 ℃保濕培養24 h后接種番茄灰霉病菌菌餅；治療作用測定方法：在保濕條件下接種番茄灰霉病菌菌餅，24 h后再噴施供試藥液。藥劑對照為腐霉利400 mg·L-1，2個菌絲塊/果實試驗重復3次，5 d后調查病斑大小，計算藥效[8]。藥效/% =(對照病斑直徑-處理病斑直徑)/對照病斑直徑×100%。(4)田間試驗：于石河子大學試驗站溫室大棚種植番茄，試驗共設3個處理，處理1：空白對照；處理2：施用腐霉利(400 mg·L-1)；處理3：施用發酵液提取物(400 mg·L-1。每個處理3次重復，隨機區組排列，小區面積20 m2，株數36株每小區第一次施藥前調查病情基數，每隔7 d施藥1次，共施藥3次，施藥后7 d調查發病情況，5點取樣，每點調查3株番茄全株葉片，統計發病情況并計算病情指數和防治效果[9]。病情分級標準如下：

0級——無病斑；

1級——病斑占整個葉面積5%以下；

3級——病斑占整個葉面積5%～15%；

5級——病斑占整個葉面積16%～25%；

7級——病斑占整個葉面積26%～50%；

9級——病斑占整個葉面積51%以上。

根據調查結果計算病情指數和防效。病情指數=∑(各級病葉數×相對應極值)/調查總葉數×9；防治效果=(1-空白對照區施藥前病情指數×藥劑處理區施藥后病情指數/空白對照區施藥后病情指數×藥劑處理區施藥前病情指數)×100%。

1.7 放線菌KN37菌株的初步鑒定(1)菌絲形態觀察：采用插片法接種菌株，用移液搶吸取50 μL孢子懸浮液于高氏一號培養基上，用涂布器將其涂布均勻，將蓋玻片斜插入培養基中，28 ℃條件下5 d后，待菌絲覆蓋于蓋玻片與培養基交叉處時，取下插片，置于光學顯微鏡下觀察其觀察菌株的基內菌絲、氣生菌絲顏色和孢子及孢子絲形態。參考阮繼生等人的方法對待測菌株進行形態觀察和顯微結構鑒定[10]。(2)菌落形態觀察：將少量的抱子絲接種于高氏一號培養基上，使其形成單菌落，28 ℃條件下5 d后，觀察菌落的形狀、顏色、質地，以及平板正、反面的特征等一系列的形態特點。(3)分子鑒定：利用EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit(全式金，中國)進行放線菌基因組DNA提取，參考王秀爽等人的方法使用通用引物8F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACG GCTACCTTGTTACGACTT-3′)對16S rDNA進行擴增[11]，PCR產物測序后進行Blast，選擇同源性較高的菌株用MEGA7.0軟件進行多序列比對，構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 放線菌KN37代謝物的抑菌譜放線菌KN37發酵液對多種植物病原菌具有較強的抑制作用(表1)，尤其是對番茄灰霉病菌、細菌性斑點病菌、番茄早疫病菌和油菜菌核病菌的抑制效果最好，抑制率分別為94.26%，93.66%，92.07%和95.67%。

表1 放線菌KN37發酵液對12種病原菌的菌落生長抑制作用Tab.1 Inhibition effect of actinomycete strain KN37 broth on 12 species of pathogens

注：抑制率為平均值±標準差(n=4)
Note：Inhibition rate is mean values ± SE(n=4)

2.2 放線菌KN37代謝物對番茄灰霉病菌的抑制作用為了進一步明確KN37菌株代謝物的抑菌效果，采用菌絲生長速率法對KN37發酵液及其乙酸乙酯提取物的毒力進行測定，結果顯示KN37發酵液的EC50為134.035 9 mg·L-1，乙酸乙酯提取物對番茄灰霉病菌的EC50為37.864 3 mg·L-1，均高于對照藥劑腐霉利的EC50值。

表2 放線菌KN37發酵液及提取物對番茄灰霉病菌菌絲生長的毒力Tab.2 The virulences of actinomycete strain KN37 broth and its extracts on mycelial growth of Botryptis cinerea

此外，放線菌KN37發酵液及其提取物也能顯著抑制番茄灰霉病菌孢子的萌發，其中發酵液處理孢子12 h后的EC50為40.300 5 mg·L-1(y= 3.233 3 + 1.100 5x，r= 0.982 0)，發酵液提取物的EC50為6.713 4 mg·L-1(y= 3.860 1 + 1.378 4x，r= 0.991 7)。KN37代謝物對孢子萌發的毒力顯著高于對菌絲生長的毒力，說明番茄灰霉病菌的孢子對KN37代謝物更為敏感。

2.3 放線菌KN37代謝物對番茄灰霉病的防治效果組織法測定結果表明，KN37發酵液提取物(400 mg·L-1)對番茄灰霉病具有較強的防治效果(圖1A)，其中保護作用(96.72%)與對照藥劑腐霉利(400 mg·L-1)效果相當，而治療作用(77.58%)顯著優于對照藥劑。從圖1B可以看出，KN37發酵液提取物施于番茄果實表面后，病原菌無法深入侵染；即使病原菌已經侵染，KN37發酵液提取物也能在一定程度上限制其進一步擴展，從而防止果實大面積腐爛的情況發生。

圖1 放線菌KN37代謝物對番茄灰霉病的保護與治療作用

利用KN37發酵液提取物(400 mg·L-1)防治溫室大棚內的番茄灰霉病，結果表明，在施用3次發酵液后番茄灰霉病的發生率明顯降低，對番茄灰霉病的防治效果可達63.12%，與對照藥劑腐霉利效果(400 mg·L-1)相當(圖2A)，且番茄植株更加粗壯，葉片更綠(圖2B)。推測KN37代謝物中不僅含有抑菌物質，還可能含有一些可以促進植物生長或誘導植物抗性的物質。

圖2 放線菌KN37代謝物對溫室大棚番茄灰霉病的防治效果

圖3 放線菌KN37菌落(A)及孢子絲形態(B)Fig.3 Colony (A) and sporotrichial (B) of actinomycete strain KN37

2.4 放線菌KN37初步鑒定放線菌KN37在高氏1號固體培養基上生長狀況良好，菌落呈乳白色，圓形，質地致密，表面干燥，內源有凹陷中間有突起皺褶，菌落周圍呈輻射狀(圖3A)。氣生菌絲顏色為乳白色，發育良好，可生成多個長橢圓形孢子，孢子絲呈螺旋狀生長(圖3B)。基內菌絲為白色，無色素分泌。通過利用16S rDNA進行BLAST序列比對，發現KN37菌株與Streptomyceskanamyceticus(NR 043822)的16S rDNA序列相似度達到96%，最為近緣(圖4)。結合形態觀察結果和分子鑒定結果，可將放線菌KN37歸屬為白色鏈霉菌類群。

圖4 基于16S rDNA序列分析的放線菌KN37系統發育樹

3 討 論

新疆喀納斯地區生態環境特殊，具有豐富的微生物資源。從當地分離得到的放線菌數量較多，其中不乏一些具有較好生物活性的菌株。韓立榮等人曾從喀納斯地區土壤中分離得到1株新放線菌StreptomyceskanasensisZX01，該菌可產生一種抗植物病毒的糖蛋白GP-1，同時，還可誘導植物產生抗病性，極具開發價值[12-13]。本課題組針對新疆高寒地區放線菌資源進行深度挖掘，目前已對天池和喀納斯地區放線菌進行了研究，從中發現具有農用活性的放線菌數量占分離得到放線菌總數的7.32%，相比青藏高原地區(5.73%)較高[14]。由此可見，新疆高寒地區放線菌資源極為豐富，有待進一步開發利用。

放線菌KN37發酵液的抑菌譜測定結果表明，其對多種植物病害均具有較好的抑制效果，如番茄灰霉病、番茄早疫病、番茄細菌性斑點病等。此外，毒力測定表明，發酵液提取物對番茄灰霉病菌的毒力較強，對菌絲生長的EC50為37.859 6 mg·L-1，對孢子萌發的EC50為6.713 4 mg·L-1。以上結果表明，KN37菌株代謝物具有高效、廣譜的殺菌特點，可進一步分離純化得到抑菌化合物后開展農藥制劑開發研究。

分子鑒定結果表明，S.kanamyceticus和KN37菌株的近緣菌(16S rDNA序列相似度為96%)，該菌為卡那霉素的產生菌。卡那霉素廣泛應用于醫療、畜牧及分子生物學方面，主要抑制細菌的蛋白質生物合成[15]。卡那霉素本身不可抑制真菌生長，但有研究發現卡那霉素經過結構改造后可抑制真菌生長[16]。通過文獻調研，未發現S.kanamyceticus代謝物具有抗真菌活性.因此,結合16S rDNA分析結果可推斷KN37菌株與S.kanamyceticus并非同一種菌，下一步可結合代謝物分析及多項分類法對KN37菌株進行鑒定。