CD74與RUNX3 在人胰腺癌細胞內存在相互作用

黃耀星，余丹純，孫小娟，江舒曼，李偉冬，賈 林

廣州市第一人民醫院消化內科，廣東 廣州 510180

胰腺癌是惡性程度最高的消化系腫瘤，發病率占我國惡性腫瘤第8位，5年生存率僅為7.2%[1]。轉移是胰腺癌患者死亡的主因[2]，發現和驗證與胰腺癌轉移有關的基因及分子機制對胰腺癌的診療有著重要意義。CD74是II型跨膜糖蛋白，可在多種癌前病變和惡性腫瘤組織中表達[3]。有文獻報道CD74與胰腺癌的預后及神經侵襲密切相關，CD74在具高神經侵襲轉移特性胰腺癌細胞Capan-2中高表達，降低CD74表達水平可抑制細胞的體外侵襲力[4-6]，而CD74在胰腺癌侵襲轉移中的作用機制尚不清楚。Gil-Yarom等[7]在淋巴細胞研究中發現，CD74的胞內段可能與RUNX1和RUNX3結合，作為轉錄因子發揮作用。目前已有報道證實RUNX3是胰腺癌轉移的分子開關[8]，而胰腺癌細胞CD74內源化后能否激活類似淋巴細胞的下游信號通路目前尚無研究報道。

為在活體胰腺癌細胞內證實CD74與RUNX3之間的相互作用，本研究采用前期構建的CD74-siRNA慢病毒載體轉染Capan-2細胞，利用免疫共沉淀技術驗證CD74與RUNX3是否存在蛋白相互作用，為胰腺癌侵襲轉移機制提供更多的實驗證據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人胰腺癌Capan-2細胞株（北京北納創聯）；慢病毒載體（Clonetech）、pSUPERretro-puro質粒（Oligoengine）、Lipofectamin 2000（Invitrogen）；DH5α感受態細胞、293T細胞（廣州博川生物）；限制性內切酶（NEB）；質粒提取試劑盒（北京天根生化）；10%胎牛血清RPMI-1640培養基、DMEM培養基（Gibco）；Trizol試劑盒、CD74、RUNX3引物（Invitrogen）、RT-PCR所需DNA聚合酶和Sybrgreen試劑（TaKaRa）；鼠抗人CD74和RUNX3（Abcam），羊抗鼠二抗、β-actin（Santa Cruz）；免疫共沉淀試劑盒Anti-HA Immunopreci-pitation Kit（IP 0010，Sigma）；BCA-100蛋白質定量試劑盒（上海博彩生物）；ECL化學發光試劑盒（北京普利萊）。

1.2 CD74-siRNA慢病毒載體構建

采用課題組前期研究篩選的CD74-siRNA最佳抑制序列和慢病毒載體，酶切鑒定正確后包裝質粒，磷酸鈣法轉染293T細胞，收獲并濃縮病毒上清液，-80 ℃冰箱保存備用[9]。

1.3 細胞培養和慢病毒感染

人胰腺癌Capan-2細胞在含10%胎牛血清、青鏈霉素的RPMI-1640培養基，37 ℃、5% CO2恒溫箱中培養。取狀態良好細胞接種于25 cm2培養皿，待融合度達80%～90%時，按照慢病毒轉染說明操作。分為對照組（空白載體）和實驗組（CD74-siRNA），每組按1：1000濃度加入4 μg/mL的聚凝胺，12 h后更換正常培養液，第2天重復進行，共感染4次；感染結束后加入0.5 μg/mL嘌呤霉素篩選陽性克隆3 d以上；每日更換培養液，觀察并去除死細胞，細胞長滿后凍存（P0代）并傳代，收集P2代細胞評估轉染效率。

1.4 實時熒光定量PCR

Trizol法提取兩組細胞的總RNA，測定RNA純度和濃度，逆轉錄合成cDNA，利用Primer 5.0軟件設計引物，CD74、RUNX3、β-Actin等引物序列（表1）。擴增條件：95 ℃預變性30 s、95 ℃10 s、60 ℃10 s、72 ℃10 s，40個循環；72 ℃延伸10 min。讀取Ct值，以 2-△△Ct值代表各組mRNA相對表達量。

表1 引物的序列

1.5 Western blot檢測

兩組細胞在冰上操作，RIPA裂解并提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。將蛋白分為2份，一份用于Western blot，另一份用于免疫共沉淀。以總蛋白20 μg進 行 10%SDS-PAGE電 泳 ， 電 轉 膜 至 PVDF，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入1：1000稀釋的鼠抗人CD74、RUNX3一抗，4 ℃孵育過夜。TBST洗滌后加入羊抗鼠二抗，室溫孵育1 h，ECL發光法顯影拍照，β-actin為內參。Image J軟件分析計算CD74、RUNX3和β-actin蛋白相對表達量。

1.6 正反向免疫共沉淀實驗

按照免疫共沉淀試劑盒說明書操作。Capan-2細胞經RIPA裂解提取蛋白后，分為正向和反向免疫共沉淀組，各取裂解液分別加入1 μg的CD74抗體和RUNX3抗體，4 ℃緩慢搖晃孵育過夜；將用緩沖液預處理過的10 μL HA瓊脂糖beads加入和抗體孵育過夜的細胞裂解液中，4 ℃緩慢搖晃孵育2～4 h，使抗體與HA瓊脂糖beads偶連；免疫沉淀反應后，在4 ℃條件下以12 000 r/min速度離心30 s，將瓊脂糖beads離心至管底；小心吸去上清，瓊脂糖beads用1 mL裂解緩沖液洗3～4次；最后加入15～20 μL的1×SDS上樣緩沖液，100 ℃煮5 min。上述樣品用10%的SDS-PAGE電泳，并進行Western blot分析（同實驗1.5步驟）。

1.7 統計學方法

數據采用SPSS 19.0進行統計學處理。計量資料以均數±標準差表示，兩組均數比較采用t檢驗，多個樣本均數比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 siRNA慢病毒轉染對細胞CD74蛋白和mRNA表達的影響

Western blot結果顯示，實驗組CD74蛋白相對表達量為0.09±0.01，對照組CD74蛋白相對表達量為2.78±0.04，實驗組CD74蛋白表達量較對照組顯著下降（P＜0.05，圖1）；qRT-PCR結果顯示，實驗組與對照組CD74 mRNA的2-△△Ct值分別為0.39±0.001、1.00±0.00，CD74-siRNA慢病毒轉染可抑制CD74 mRNA的表達（P＜0.05，圖2）。

圖1 兩組細胞CD74和RUNX3蛋白表達差異

圖2 兩組細胞CD74 mRNA表達差異

2.2 抑制CD74對細胞RUNX3蛋白和mRNA表達的影響

實驗組與對照組的RUNX3相對蛋白表達量為0.006±0.0004、1.24±0.09（圖1）；qRT-PCR結果顯示，實驗組與對照組RUNX3 mRNA的2-△△Ct值分別為0.53±0.02、1.00±0.00；抑制CD74可降低Capan-2細胞RUNX3蛋白與mRNA的表達量（P＜0.05，圖3）。

圖3 兩組細胞RUNX3 mRNA表達差異

2.3 免疫共沉淀法驗證CD74與RUNX3 在細胞內相互作用

用CD74抗體與Capan-2細胞的總蛋白裂解液進行免疫共沉淀，免疫復合物經電泳轉膜后，進一步用CD74抗體和RUNX3抗體進行Western blot分析。結果表明，Western blot能在免疫復合物中檢測到RUNX3蛋白。

繼而用RUNX3抗體與Capan-2細胞的總蛋白裂解液進行反向免疫共沉淀，免疫復合物經電泳轉膜后，同樣用CD74抗體和RUNX3抗體進行WB分析。結果表明，WB法能在免疫復合物中檢測到CD74蛋白，Capan-2細胞株中CD74與RUNX3存在相互作用（圖4）。

圖4 免疫共沉淀結果

3 討論

胰腺癌患者預后在過去十余年間未能得到顯著改善，其診斷大多預示患者迅速痛苦的死亡發生，高侵襲轉移傾向是該疾病的特征標志[10]。近年來，有關胰腺癌發生發展的遺傳和基因變化的研究取得一些進展，希望能夠在分子水平找到更好的診治胰腺癌解決辦法。目前已知CD74表達與多種惡性腫瘤進展和轉移有關。在胰腺癌領域，Hustinx等[11]發現CD74在胰腺癌組織中高表達，Nagata等[12]認為CD74是胰腺癌的獨立預后因子。前期研究表明，CD74不但在胰腺癌組織中高表達，而且與神經侵襲程度呈正相關；通過體外實驗抑制細胞CD74的表達，可降低細胞增殖、遷移和侵襲等能力[5-6]。上述研究結果提示CD74可能作為胰腺癌治療一個新靶點，而隨著近年Immunomedics公司研制出以CD74為靶點的人源化Milatuzumab，并和阿霉素構成抗體偶聯藥物，使得臨床抗CD74策略治療血液系統惡性腫瘤成為可能[13-15]。

目前，CD74在胰腺癌中是否有著與血液腫瘤相似的作用通路和機制尚未完全闡明。有研究報道CD74可作為巨噬細胞遷移抑制因子的細胞表面受體，兩者結合后誘導系列信號傳導途徑，包括CD74膜內段切割、細胞內結構域（CD74-ICD）釋放等方式發揮作用[16-17]。有研究發現，B淋巴細胞胞內CD74-ICD可與轉錄因子RUNX（Runt相關轉錄因子）相互作用，CD74活化后RUNX3水平可顯著上調，共同形成蛋白復合物，但復合物的確切功能尚不清楚，提示CD74可能作為一種新轉錄因子在腫瘤細胞中發揮作用[5]。RUNX3基因是近年來發現的新抑癌基因，Whittle等[8]發現RUNX3是調節胰腺癌轉移的分子開關，高水平的RUNX3意味著高轉移潛能，如果RUNX3低水平，轉移風險則相對較低，有助于幫助胰腺癌臨床治療策略的選擇[18-19]；Rossi等[20]對動物模型的研究也發現RUNX3能夠促進PDAC轉移。

綜上所述，本研究推測CD74在胰腺癌細胞中可能存在相似的作用機制，調節RUNX3通路進而影響侵襲和轉移，但國內外尚未見在胰腺癌研究中有相關報道。為此，本實驗在前期構建CD74-siRNA慢病毒載體基礎上，轉染人胰腺癌Capan-2細胞抑制CD74表達，觀察CD74水平與RUNX3表達之間的關系；運用免疫共沉淀技術進一步確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用[21]。研究結果表明，與對照組相比，抑制Capan-2細胞CD74基因表達可顯著降低RUNX3蛋白和mRNA表達量，正向和反向免疫共沉淀法均證實CD74與RUNX3在Capan-2細胞內可形成復合物，RUNX3參與調控CD74激活后人胰腺癌Capan-2細胞的生物學行為，為臨床靶向CD74治療胰腺癌提供了實驗室證據。

但CD74和RUNX3蛋白之間是緊密結合還是短暫相互作用，復合物如何調控胰腺癌細胞其他基因表達及其具體機制，尚需在后續實驗中加以完善。