絞股藍中6 種多酚化合物的HPLC檢測及其醇提液的抗氧化活性

鄧俊琳，朱永清，夏 陳,*，陳 建，趙旭珠，張盈嬌，李華佳，鄧海云，李 娟

（1.四川省農業科學院農產品加工研究所，四川 成都 610066；2.四川大學華西公共衛生學院，四川 成都 610041）

絞股藍屬（Gynostemma）為葫蘆科草質藤本植物，共包括16 個種2 個變種，主要分布于亞洲熱帶，中國地區主要分布于秦嶺以南廣大地區[1]。絞股藍（G. pentaphyllum (Thumb.) Makino）是該屬分布最廣、資源最豐富的藥用植物，為該屬的模式物種，有5 葉、7 葉和9 葉等生態類型，以5 葉和7 葉最為常見[2-3]。研究認為絞股藍含有與人參皂苷相似結構的絞股藍皂苷，是除五加科外少數被證實含有人參皂苷類成分的植物，因此在醫藥領域和保健品領域都有很大的市場發展空間[1]。我國對絞股藍的應用由來已久，民間將其作為野菜食用，同時其又被當作草藥治療咳嗽、痰喘、慢性支氣管炎等疾病，是一種經典的藥食同源類植物[4]。研究表明絞股藍含有皂苷、黃酮類、多糖和氨基酸等多種化學成分，具有降血糖血脂[5-7]、免疫調節[8]、抗衰老和保護心血管[9]等作用。在四川絞股藍屬植物有3 種：心籽絞股藍（G. cardiospermum）、長梗絞股藍（G. longies）和絞股藍（G. pentaphyllum），前2 種分布于四川盆地周緣山地，后者則廣泛分布于四川盆地和川西南山地[10]。

多酚類化合物是植物中一類物質的統稱，因具有多個酚羥基而得名，是植物的次生代謝產物，大多數由苯丙氨酸衍生而來，少部分由酪氨酸衍生而來。按結構大致可分為類黃酮、木聚素、酚酸和木酚素[11]。多酚類化合物在種子萌發、植物生長和發育、細胞分裂、光合作用色素的合成、植物抗霜凍和防御病蟲害等過程中均起到重要作用[12-13]。同時對人類健康也具有保護作用，多酚具有預防心血管病發生、抑菌、抗病毒、提高免疫等多種功效[14-16]，且這些活性與多酚的抗氧化活性直接相關[17-18]。目前對絞股藍中活性成分的研究多集中在絞股藍皂苷、多糖等，但對絞股藍中多酚類化合物的研究較少。本實驗對四川西南山地野生絞股藍（生態類型：5 葉、7 葉、9 葉）和人工種植絞股藍（生態類型：7 葉）葉及莖中多酚單體化合物進行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法分析檢測，以及對其醇提液的總多酚含量和抗氧化活性進行研究，以期為絞股藍的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

絞股藍：2016年4月采收于四川省樂山市峨邊彝族自治縣，野生絞股藍：生態類型分別為5 葉、7 葉和9 葉；人工種植絞股藍：生態類型為7 葉。野生絞股藍和人工種植絞股藍經云南省農業科學院藥用植物研究所專家李晚誼鑒定并確認。樣品存檔于四川省農業科學院農產品加工研究所功能食品研究室。干葉和莖粉碎過60 目篩，貯藏備用。

原兒茶素、對羥基苯甲酸、蘆丁、異槲皮苷、槲皮素、山柰酚標準品（色譜純，純度≥98%），2,2’-聯氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS） 北京索萊寶科技有限公司；乙腈、甲醇（均為色譜純）、0.22 μm微孔濾膜 美國Mreda公司；甲酸、福林-酚試劑、AlCl3、沒食子酸、水溶性VE（均為分析純） 成都市科龍化工試劑廠；1,1-二苯基-2-苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH，純度＞97%） 東京化成工業株式會社。

1.2 儀器與設備

FW-100高速萬能粉碎機 北京科偉永興儀器有限公司；TD-4Z型臺式低速離心機 四川蜀科儀器有限公司；KH2200DE型數控超聲波清洗器 昆山禾創超聲儀器有限公司；ELX-800型號酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；1260型HPLC儀（配有二極管陣列檢測器）、poroshell 120 PFP色譜柱（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）美國Agilent公司；UV-6100型紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 供試樣品溶液的制備

稱取絞股藍粉末0.2 g，加10 mL甲醇，于40 ℃超聲提取40 min，甲醇定容至10 mL容量瓶中。0.22 μm微孔濾膜過濾，作為樣品HPLC檢測的待測液，其余樣品用于總多酚含量和抗氧化活性（DPPH、ABTS）的測定。

1.3.2 標準品溶液的制備

溶解原兒茶素、對羥基苯甲酸、蘆丁、異槲皮苷、槲皮素、山柰酚標準品20 mg，分別用甲醇溶解并定容至10 mL作為標準品母液。采用梯度稀釋法用甲醇將各標準品母液配制成一系列質量濃度梯度的標準品溶液，備用。

1.3.3 色譜條件

poroshell 120 PFP色譜柱（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）；檢測波長254 nm和350 nm；柱溫30 ℃；進樣量5 μL；流速0.8 mL/min；流動相：1%甲酸（A）-乙腈（B）；梯度洗脫：0～10 min，5%～10% B；10～20 min，10%～20% B；20～35 min，20%～40% B；35～40 min，40%～70% B；40～45 min，70%～95% B。

1.3.4 方法學考察

1.3.4.1 標準曲線、定量限和檢出限[19]

精密吸取含有6 種多酚單體的混合標準品，分別稀釋2、4、8、16、32、64、128、256、512 倍，在1.3.3節色譜條件下進樣測定，計算峰面積。以標準品質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標，以峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線。并將信噪比為10時相應的質量濃度定為定量線，以信噪比為3時的相應質量濃度確定為檢出限。

1.3.4.2 重復性實驗

按照1.3.1節的方法平行制備6 份7 葉絞股藍提取液，按1.3.3節色譜條件進樣5 μL進行測定，計算6 種多酚化合物提取量的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.4.3 精密度實驗

按照1.3.2節方法制備的標準溶液，按1.3.3節色譜條件連續進樣6 次，計算6 種多酚化合物峰面積的RSD。

1.3.4.4 穩定性實驗

按照1.3.2節方法制備的標準溶液，按1.3.3節色譜條件對同一樣品分別在0、2、4、6、8 h進樣5 μL，計算6 種多酚化合物峰面積的RSD。

1.3.4.5 回收率實驗

稱取絞股藍樣品適量于具塞錐形瓶中，加入6 種標準品適量，按1.3.1節的方法制備7 葉絞股藍樣品，再按1.3.3節色譜條件進樣5 μL，并計算6 種化合物的加標回收率。

1.3.5 總多酚含量測定[20]

以沒食子酸質量濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：Y=0.002 9X+0.026 3（R2=0.998 2，線性范圍17.55～351 μg/mL）。

取100 μL待測液，加3.0 mL蒸餾水搖勻，再加200 μL福林-酚試劑，混勻放置5 min，再加800 μL 10%碳酸鈉溶液，避光反應60 min，于波長765 nm處測吸光度。總多酚含量以沒食子酸當量計算，單位為mg/g。

1.3.6 DPPH自由基清除活性測定[21]

以水溶性VE質量濃度（μg/mL）為橫坐標，清除率為縱坐標，制作標準曲線。得回歸方程：Y＝0.942 8X-0.420 2（R2＝0.997，線性范圍13～104 μg/mL）。

取200 μL待測液，加2 mL DPPH（0.1 mmol/L）溶液，混勻，避光反應30 min，于波長517 nm處測吸光度。DPPH自由基清除活性以VE當量計算，單位為mg/g。

DPPH自由基清除率按下式計算：

式中：Ax為樣品的吸光度；A0為乙醇代替樣品時的吸光度。

1.3.7 ABTS陽離子自由基清除活性測定[22]

以水溶性VE的質量濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，制作標準曲線。得回歸方程：Y=-0.024 6X+0.515 8（R2=0.998，線性范圍0～19.5 μg/mL）。

取400 μL待測液，加1.6 mL ABTS溶液，混勻，避光反應6 min，于波長734 nm處測吸光度。ABTS陽離子自由基清除活性以VE當量計算，單位為mg/g。

1.4 數據處理

所有數據均為3 次重復實驗的平均值，應運Microsoft Excel 97-2003和SPSS 20.0對數據進行處理和分析。

2 結果與分析

2.1 多酚標準品溶液和絞股藍樣品的HPLC檢測

圖1 多酚標準品和野生絞股藍（7 葉）樣品HPLC圖Fig. 1 HPLC chromatograms of phenolic standards and phenolics from leaves of wild seven-leaf G. pentaphyllum

從圖1A、B可以看出，在此色譜條件下，6 種多酚化合物的標準品得到較好分離，野生絞股藍（7 葉）的葉樣品溶液色譜圖（圖1C、D）中6 個目標峰的保留時間與標準品溶液的6 個色譜峰保留時間一致。在此色譜條件下，絞股藍樣品中的6 種多酚化合物得到較好的分離。

2.2 方法學驗證

2.2.1 標準曲線、定量限和檢出限結果

表1 6 種多酚化合物的回歸方程、線性范圍、定量限和檢出限Table 1 Regression equations and linear ranges for the 6 phenolic compounds

如表1所示，各種化合物的峰面積和質量濃度之間呈良好的線性關系。

2.2.2 重復性實驗結果

6 種多酚化合物提取量的RSD分別為2.23%、4.11%、1.95%、2.51%、4.60%、2.21%，表明實驗方法重復性良好。

2.2.3 精密度實驗結果

6 種多酚化合物峰面積的RSD分別為2.68%、2.63%、0.89%、1.01%、1.57%、0.69%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 穩定性實驗結果

6 種多酚化合物峰面積的RSD分別為2.45%、1.80%、0.97%、0.60%、1.47%、0.56%，表明6 種多酚的日內穩定性良好。

2.2.5 回收率實驗結果

表2 6 種多酚化合物在絞股藍樣品中的加標回收率（n=5）Table 2 Recovery rates of phenolic compounds from spiked sample (n= 5)

如表2所示，6 種化合物的加標回收率在84%～99%之間，RSD均小于5%，表明實驗方法有較好的回收率，回收結果準確可靠。

2.3 多酚、總多酚含量和抗氧化活性測定

如表3所示，6 種多酚化合物中，蘆丁含量均顯著高于其他5 種多酚化合物，其次槲皮素含量較高，原兒茶酸和對羥基苯甲酸含量則相對較低。在不同絞股藍樣品中，野生絞股藍（5 葉）葉中的原兒茶酸、蘆丁、槲皮素、山柰酚含量顯著高于其他樣品。野生絞股藍（7 葉）葉中對羥基苯甲酸含量、總多酚含量、抗氧化活性高于其他品種，其中，總多酚含量高達75 mg/g，而野生絞股藍（7 葉）的莖中總多酚含量、抗氧化活性較其他樣品低。此外，總多酚含量在絞股藍中均呈現出葉中含量遠高于莖中，且遠高于Cai Yizhong等[23]報道的絞股藍中總多酚含量（4.4 mg/g）。

表3 絞股藍中6 種多酚、總多酚含量和抗氧化活性Table 3 Contents of 6 phenolic compounds and total phenols and antioxidant activity in G. pentaphyllummg/g

2.4 相關性分析

表4 相關性分析Table 4 Correlation analysis

如表4所示，絞股藍醇提液對DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的清除能力均與總多酚含量呈極顯著正相關，且二者之間也呈極顯著正相關。對DPPH自由基的清除能力與6 種多酚化合物含量呈現極顯著正相關。對ABTS陽離子自由基的清除能力與蘆丁和異槲皮苷之間無顯著相關性，與槲皮素顯著正相關，與原兒茶酸和對羥基苯甲酸、山柰酚等均呈現極顯著正相關。異槲皮苷含量與總多酚含量之間無顯著相關性，總多酚與其他5 種多酚均有顯著正相關性。6 種多酚化合物之間，槲皮素與異槲皮苷無顯著相關性，對羥基苯甲酸與蘆丁、異槲皮苷之間無顯著相關性，其余多酚化合物之間均呈現極顯著或顯著正相關性。

3 討 論

本研究建立了HPLC法檢測絞股藍中6 種多酚化合物的方法，經驗證該方法重復性好（RSD≤4.6%）、精密度高（RSD≤2.68%）、穩定性好（RSD≤2.45%）、加標回收結果準確可靠（RSD≤4.02%），可在35 min內對6 種多酚化合物進行有效分離，峰形對稱、分離度高。

植物多酚在植物的生長和發育過程中起到重要的作用，其不僅與種子萌發、細胞分裂、色素合成等密切相關，還能保護植物受傷部位、提高植物對微生物侵襲的抵抗能力[24]。本研究中人工種植絞股藍（7 葉）的葉中總多酚含量（11.78 mg/g）接近于?amec等[25]報道的生長于馬來西亞和德國的絞股藍中總多酚的含量（11.57 mg/g和10.42 mg/g），而野生絞股藍的葉中總多酚含量均較高（均高于30 mg/g），這可能與野生絞股藍在野外的生長環境有關。此外，6 種多酚化合物之間有顯著或極顯著正相關，且在同一供試樣品的葉中含量均高于莖中，在不同供試樣品中，蘆丁含量均為最高，原兒茶酸和對羥基苯甲酸含量則相對較低。研究表明影響植物中多酚化合物的組成及含量的因素很多，比如遺傳因子、氣候因子[26]、土壤因子[27]等，且在同一株植物體上，部位不同，多酚含量也會有所差異[28]。

植物多酚類化合物的抗氧化活性常被作為植物功效評價的重要指標之一。本研究結果表明，DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力與總多酚含量極顯著正相關，清除DPPH自由基活性與6 種多酚的含量極顯著正相關，但蘆丁和異槲皮苷的含量對絞股藍醇提物的清除ABTS陽離子自由基活性并無顯著影響。山柰酚、槲皮素、異槲皮苷和蘆丁屬于黃酮醇類化合物，研究表明山柰酚在黃烷酮3-羥化酶催化下形成槲皮素，槲皮素經黃酮醇-3葡萄糖轉移酶的催化作用形成異槲皮素，異槲皮素再經1,6-鼠李糖基轉移酶的催化下形成蘆丁[29-30]，但在本實驗中異槲皮苷與槲皮素之間并未表現出顯著相關性。絞股藍中黃酮成分可能隨產地、氣候等差異有所不同，且其藥效受到顯著影響[31-32]。