烹飪方式對(duì)桑葉生物堿類和酚類物質(zhì)的影響

俞燕芳，石旭平，黃金枝，夏裕輝，彭曉虹，杜賢明，王軍文，鄧澤元*

（1.江西省蠶桑茶葉研究所，江西 南昌 330202；2.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

桑葉含豐富的營養(yǎng)和功能活性成分，是一種“藥食兩用”原料。桑葉具有疏風(fēng)散熱、清肺潤燥、清肝明目的功效，可用于風(fēng)熱感冒、肺熱燥嗽、頭暈頭痛、目赤昏花等癥治療[1]。此外，桑葉被廣泛用于生產(chǎn)茶飲料、面點(diǎn)、餅干等食品。近年來，桑葉菜（桑芽）作為一種“特色蔬菜”逐漸興起并且受到消費(fèi)者的青睞，各種桑葉菜式不斷出現(xiàn)[2-4]。

酚類和生物堿類化合物是桑葉的重要功能活性成分，其含量變化會(huì)影響桑葉的保健品質(zhì)。生物堿類成分，以1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）為代表，是高效的糖苷酶抑制劑，能顯著抑制餐后血糖上升，具有降血糖、減肥、抗炎和抗病毒等作用[5-7]。酚類物質(zhì)是天然強(qiáng)抗氧化劑，具有抗衰老、降血脂、抗腫瘤等作用[8-9]。

已有研究表明，不同的桑葉茶加工工藝、提取方法、干燥方式等會(huì)影響桑葉中黃酮類化合物和DNJ的含量[10-13]。而蒸、煮、炸等常用的家庭烹飪方式對(duì)其營養(yǎng)和活性成分的研究鮮見報(bào)道。雖然國內(nèi)外已有較多文獻(xiàn)報(bào)道蔬菜加工過程中營養(yǎng)成分的變化，但是由于材料和加工方式不同，不同的實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果差異較大。為此，本實(shí)驗(yàn)研究不同烹飪方式對(duì)桑葉酚類化合物和DNJ的影響，以選擇適合的加工方法，為桑葉菜和桑葉食品加工提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葉2017年9月1日采自江西省蠶桑茶葉研究所，品種為農(nóng)桑14號(hào)，采枝條頂部2～3 片幼嫩展開葉。

綠原酸、沒食子酸、蘆丁、槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷、槲皮素、山柰酚、DNJ標(biāo)準(zhǔn)品、芴甲氧羰酰氯（methoxycarbonyl chloride，F(xiàn)MOC-Cl） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；紫云英苷標(biāo)準(zhǔn)品 四川省維克奇生物生物科技有限公司；福林-酚試劑 上海荔達(dá)生物科技有限公司；乙腈、甲醇、甲酸（色譜純）德國默克公司；其他分析純?cè)噭┵徸晕麟]化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜儀、6430液相色譜-高性能三重串聯(lián)四極桿-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)、Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 美國安捷倫公司；UV-2600紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；LGJ-18A真空冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)公司；SK3310HP超聲清洗器上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；P70D20N1P-G5(W0)微波爐廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑葉前處理

采集的桑葉用流水沖洗后，瀝干水分，去葉柄，切成2 cm×4 cm左右葉片，備用。

1.3.2 桑葉加工

按照常見烹飪方式對(duì)桑葉進(jìn)行處理，以真空冷凍干燥（凍干）鮮葉為對(duì)照，研究烹飪后桑葉活性成分變化情況。各處理?xiàng)l件如下：1）凍干：將新鮮桑葉裝盤，于-70 ℃冰箱預(yù)凍5～6 h后，放入真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)干燥。2）蒸：將桑葉鋪開置于蒸屜中，從水沸時(shí)計(jì)時(shí)，分別在3 min和10 min后取出，凍干后粉碎。3）微波：桑葉單層鋪在微波爐轉(zhuǎn)盤上，分批分別采用高火（700 W）加熱3 min、中火（350 W）5 min或低火（70 W）5 min，去除各個(gè)條件首次微波的桑葉，快速放入實(shí)驗(yàn)桑葉微波，取出攤涼，凍干后粉碎。4）水煮：水煮開，將桑葉（100 g）置于沸水（1 000 mL）中，加熱1、1.5、2、2.5 min后取出，瀝干水分，凍干后粉碎。5）油炸：大豆油（500 mL）加熱至冒煙，加入切好的桑葉（100 g），加熱1.5、2、3 min后取出，瀝干表面油，凍干后粉碎。

1.3.3 桑葉DNJ含量測(cè)定

參照秦櫻瑞[11]和范作卿[12]等的方法略作修改。稱取干燥桑葉粉0.1 g于10 mL EP管中，加0.05 mol/L鹽酸3 mL，渦旋1 min后超聲（150 W）處理30 min，10 000 r/ min離心15 min，取上清液。重復(fù)以上步驟提取1 次，合并2 次上清液，用0.05 mol/L鹽酸定容至10 mL。提取液（或DNJ標(biāo)準(zhǔn)溶液）進(jìn)行衍生化反應(yīng)，高效液相色譜法測(cè)定DNJ含量。

2.4.3 色譜與質(zhì)譜條件 （1）色譜條件：色譜柱為Agilent DB-WAX毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣量為1 μL，分流進(jìn)樣（分流比10∶1）；進(jìn)樣口溫度為280℃；離子源溫度為230℃；傳輸線溫度為250℃；色譜柱程序升溫（起始溫度50℃，保持3 min；以10℃/min升至220℃，保持20 min）；載氣為氦氣，載氣流速為1.0 mL/min。（2）質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧電離源（ESI）；選擇離子掃描（SIM）模式；電子能量為70 eV。

衍生化反應(yīng)過程：在5.0 mL離心管中加入提取液（或不同質(zhì)量濃度DNJ標(biāo)準(zhǔn)溶液）100 μL和0.4 mol/L硼酸鉀緩沖液（pH 8.5）100 μL，再加入5 mmol/L的FMOC-Cl（溶于乙腈中）200 μL，混勻后25 ℃水浴20 min。加入1 mol/L甘氨酸 100 μL終止反應(yīng)，再加入1%醋酸100 μL及超純水400 μL，以0.45 μm微孔濾膜過濾，收集濾液備用。

液相色譜條件：Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%醋酸（1∶1，V/V）溶液；流速1.0 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL；熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)254 nm，發(fā)射波長(zhǎng)322 nm。

以峰面積和對(duì)應(yīng)DNJ標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為坐標(biāo)繪制DNJ標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y＝0.149x-5.281（R2＝0.999 9），x為峰面積；y為DNJ質(zhì)量濃度（μg/mL）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程計(jì)算每個(gè)樣品的DNJ質(zhì)量濃度。

1.3.4 桑葉酚類化合物含量測(cè)定

按照參考文獻(xiàn)[14]的方法略加修改提取桑葉酚類物質(zhì)。稱取干燥桑葉粉0.5 g，加入80%甲醇溶液20 mL，超聲（300 W）提取45 min，10 000 r/min離心15 min，取上清液。重復(fù)以上步驟提取1 次，合并2 次上清液，用80%甲醇溶液定容至50 mL，作為酚類物質(zhì)提取液待測(cè)。

總酚含量測(cè)定參照文獻(xiàn)[15]的方法略加修改。在25 mL比色管中加待測(cè)液（或不同質(zhì)量濃度沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液）1 mL，加入0.1 mol/L福林-酚溶液5 mL，混勻反應(yīng)5 min后，加入7.5%碳酸鈉溶液4 mL，蒸餾水定容，混勻，避光放置30 min，于波長(zhǎng)765 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度和對(duì)應(yīng)沒食子酸質(zhì)量濃度為坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y＝0.266x-0.013（R2＝0.997 6），x為吸光度，y為沒食子酸溶液質(zhì)量濃度（mg/mL）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程計(jì)算每個(gè)樣品的總酚含量，樣品總酚含量以每克干桑葉中沒食子酸當(dāng)量表示。

酚類物質(zhì)組成分析：提取液進(jìn)樣前用0.45 μm微孔微濾膜過濾。采用6430高性能液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)對(duì)桑葉各酚類成分進(jìn)行定性分析。

液相色譜條件：Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相A為0.2%甲酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈，流速為0.8 mL/min。梯度洗脫程序：0～20 min，10%～15% B；20～50 min，15%～35% B；50～60 min，35%～50% B；60～7.00 min，50%～100% B；每個(gè)程序后運(yùn)行10 min。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，負(fù)離子模式；干燥氣流速11 L/min，干燥氣溫度300 ℃，毛細(xì)管電壓4 kV，碰撞能量30 eV，碰撞電壓80 V，質(zhì)量掃描范圍m/z 100～1 000。根據(jù)質(zhì)譜提供的離子碎片數(shù)據(jù)參照相關(guān)文獻(xiàn)[16-17]對(duì)桑葉各酚類成分進(jìn)行定性分析。采用1260高效液相色譜系統(tǒng)對(duì)各個(gè)樣品所含的酚類化合物進(jìn)行定量分析，液相色譜條件同上，紫外檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm。根據(jù)酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰保留時(shí)間和峰面積-質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各個(gè)酚類物質(zhì)含量。所有標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，用Excel 2007和IBM SPSS Statistics 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以 ±s表示，多重比較采用Duncan法。

2 結(jié)果與分析

2.1 加工方式對(duì)桑葉DNJ含量的影響

如圖1所示，與凍干桑葉相比，其他所有處理桑葉DNJ含量均顯著下降，下降幅度為：油炸＞水煮＞微波＞蒸。油炸1.5 min組的DNJ含量顯著高于油炸2.5 min和3.5 min組，油炸2.5 min的DNJ含量為0.44 mg/g，與凍干桑葉DNJ含量（5.90 mg/g）相比，下降了92.5%；在水煮處理組之間，隨著水煮時(shí)間延長(zhǎng)，桑葉中的DNJ含量逐漸降低；不同微波處理之間DNJ含量無顯著性差異，在4.23～4.40 mg/g之間；蒸3 min的DNJ含量為5.57 mg/g，接近凍干桑葉，隨蒸的時(shí)間延長(zhǎng)，其含量也降低。總體說明DNJ含量與烹飪介質(zhì)（水、油）、溫度、時(shí)間等有很大關(guān)系。

圖1 加工方式對(duì)桑葉DNJ含量的影響Fig. 1 Effects of cooking methods on DNJ content of mulberry leaves

蒸汽（100 ℃）不會(huì)破壞DNJ分子的結(jié)構(gòu)使其降解，所以蒸汽處理桑葉DNJ保留較好，少量DNJ可能在蒸的過程中隨水分溶出損失。DNJ是一種水溶性生物堿，有研究表明桑葉茶98 ℃浸泡400 s大約95% DNJ能被浸提出[18]，因此桑葉水煮時(shí)間不能過長(zhǎng)。

溫度過高會(huì)降低DNJ的穩(wěn)定性使其含量下降。范作卿等[12]研究表明在桑葉茶加工過程中，微波殺青（1 350 W，150 s）、蒸汽殺青（2 min）、滾筒殺青（255 ℃，30 s）均可增加DNJ含量，在125 ℃加熱處理15 min后，桑葉茶中DNJ的含量達(dá)到最大值，但250 ℃加熱15 min后，DNJ含量的破壞較大，推測(cè)短時(shí)高溫導(dǎo)致桑葉中的DNJ類似物或DNJ糖苷等物質(zhì)的結(jié)構(gòu)破壞，轉(zhuǎn)化為DNJ，時(shí)間延長(zhǎng)DNJ可能會(huì)被破壞降解。油炸過程中局部溫度可達(dá)200 ℃以上，DNJ降解顯著。

微波也會(huì)造成DNJ結(jié)構(gòu)被破壞或發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而含量降低。劉超等[19]研究發(fā)現(xiàn)微波可以明顯破壞桑枝提取液DNJ的穩(wěn)定性，微波處理時(shí)間越長(zhǎng)，功率越大，DNJ含量下降的速率越快，800 W微波處理1 h可使DNJ損失達(dá)65%，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不完全一致，可能是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)處理時(shí)間較短，桑葉中一些黏性物質(zhì)的物理作用或某些成分之間的分子間作用對(duì)DNJ可能起到了保護(hù)作用，使其穩(wěn)定性強(qiáng)于提取液。盛琳波等[20]研究表明桑樹乳汁在不同溫度條件下（常溫、4、-18 ℃）保存DNJ含量相對(duì)穩(wěn)定，但其粗提液中的DNJ含量有顯著下降。

2.2 加工方式對(duì)桑葉總酚含量的影響

由圖2可以看出，不同烹飪方式對(duì)桑葉總酚含量影響顯著，蒸3 min的桑葉總酚含量最高，為29.64 mg/g，比凍干桑葉（27.50 mg/g）提高2.14 mg/g。蒸10 min后桑葉總酚含量與凍干桑葉無顯著差異。微波、水煮和油炸后桑葉的總酚顯著降低，其中微波低火處理5 min后桑葉的總酚含量最低，只有1.09 mg/g，微波高火3 min和中火5 min桑葉總酚含量分別為19.89 mg/g和10.32 mg/g。油炸桑葉2.5 min和3.5 min總酚含量沒有明顯差異，低于油炸1.5 min，但整體高于水煮桑葉；隨著水煮時(shí)間延長(zhǎng)，桑葉中的總酚含量呈降低趨勢(shì)，水煮2.5 min后桑葉總酚含量?jī)H為7.42 mg/g。

圖2 烹飪方式對(duì)桑葉總酚含量的影響Fig. 2 Effects of cooking methods on total phenolics content of mulberry leaves

研究表明水煮、清炒、微波等加工方式會(huì)引起酚類結(jié)構(gòu)改變和含量的降低，蒸制能夠保留更多的酚類成分，甚至使酚類物質(zhì)含量升高[21-28]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。因?yàn)榕腼冞^程對(duì)食物組分的影響機(jī)制復(fù)雜，一方面熱處理可以降低酚類氧化酶活性，抑制酚類物質(zhì)的氧化和聚合，同時(shí)高溫可以誘導(dǎo)破壞細(xì)胞壁，促使食物組織結(jié)構(gòu)分解和活性物質(zhì)溶解、釋放，從而提高其提取效率；另一方面，游離的酚類物質(zhì)在水中又極易發(fā)生轉(zhuǎn)化、聚合、降解等，從而使含量降低。加工溫度、濕度和時(shí)間是影響活性成分結(jié)構(gòu)和含量的重要因素[29-31]。

Giallourou等[32]發(fā)現(xiàn)水煮（90 ℃，2～10 min）后豆瓣菜中的總酚含量顯著降低，而微波（1 400 W，1～3 min）和蒸（5～15 min）可以保留大部分酚類物質(zhì)。王耀紅等[29]研究表明微波（700 W，3.5 min）和蒸制（100 ℃，15 min）的馬鈴薯中的自由態(tài)多酚類物質(zhì)和結(jié)合態(tài)多酚均高于水煮（100 ℃，15 min）馬鈴薯。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蒸制（100 ℃，3～10 min）和微波（700 W，3 min）處理的桑葉總酚含量高于水煮（100 ℃，1～2.5 min）處理，但是微波（70 W，5 min）處理桑葉嚴(yán)重褐變，酚類含量最低。可能是因?yàn)樯Ｈ~多酚氧化酶的最適反應(yīng)溫度為40 ℃，超過70 ℃酶活急劇下降[33]；蒸制（100 ℃）和微波（700 W）產(chǎn)生的高溫能在短時(shí)間內(nèi)使多酚氧化酶快速失活，而低火微波（70 W）加熱處理5 min不能完全鈍化酶類，但破壞了細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，反而增加了酶與底物的接觸機(jī)會(huì)進(jìn)而促進(jìn)了酶促褐變[34]。

油炸處理反應(yīng)體系比其他處理更為復(fù)雜。油炸過程中食物受熱溫度顯著高于其他處理組，此外，美拉德反應(yīng)發(fā)生也會(huì)極大改變食物組成成分和結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致酚類物質(zhì)變化[30]。桑葉經(jīng)過油炸處理后總酚含量低于蒸制處理，但高于水煮處理，這與前人的研究結(jié)果一致。Tian Jinhui等[35]發(fā)現(xiàn)油炸土豆只能保留少量的植物化學(xué)物，而蒸制和微波能保留大部分。Ramirez-Anaya等[36]研究發(fā)現(xiàn)土豆、番茄和南瓜在烹飪時(shí)以初榨橄欖油作為傳熱介質(zhì)（油炸和清炒）其總酚含量顯著高于以水為介質(zhì)（水煮）。因?yàn)樗髸?huì)使很多物質(zhì)遇熱聚合、水解且隨水流失，從而使其含量顯著下降[37]，而水溶性物質(zhì)難以自發(fā)遷移至極性介質(zhì)中。

也有研究[38-39]表明水煮或微波處理后酚類總酚含量增加。不同作者研究的結(jié)果不完全一樣，即使采用相同的工藝加工不同種類蔬菜，多酚變化結(jié)果也不同[26,39]，主要原因是蔬菜種類不同，其各組分含量不同，而且不同酚類單體組分的穩(wěn)定性不同。

2.3 加工方式對(duì)桑葉酚類物質(zhì)組成的影響

桑葉中主要有綠原酸、蘆丁、異槲皮素、紫云英苷、槲皮素-3-O-丙二酰基-葡萄糖苷（quercetin-3-O-malonyl-β-D-glucoside，QMG）和山柰酚-3-O-丙二酰基-葡萄糖苷（kaempferol-3-O-malonyl-glucoside，KMG）等酚類物質(zhì)[13,16]。QMG經(jīng)過高溫處理可能會(huì)脫去一個(gè)CO2基團(tuán)生成槲皮素-乙酰基-葡萄糖苷（quercetin-acetylglucoside，QAG）[13,16]。

表1 烹飪方式對(duì)桑葉酚類組成和含量的影響Table 1 Effects of cooking methods on the contents of individual phenolic compounds of mulberry leaves μg/100 g

圖3 凍干（A）和油炸（B）桑葉樣品的酚類物質(zhì)色譜圖Fig. 3 HPLC chromatograms of phenol compounds from freeze-dried(A) and deep-fried (B) mulberry leaves

如圖3和表1所示，凍干桑葉綠原酸、蘆丁、異槲皮素、QMG、紫云英苷和KMG含量分別為69.24、20.68、6.74、10.39、3.71 μg/100 g和2.44 μg/100 g。

不同烹飪處理后桑葉的主要酚類物質(zhì)及含量蒸3 min使桑葉綠原酸、異槲皮素、QMG、紫云英苷和KMG含量顯著升高（P＜0.05），蘆丁和KAG含量保持不變。蒸10 min桑葉蘆丁、QMG、KMG和KAG含量顯著下降（P＜0.05）。短時(shí)蒸汽處理使綠原酸等物質(zhì)含量上升的原因可能是高溫使結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)釋放出來，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，部分物質(zhì)會(huì)發(fā)生降解或隨水流失。水煮處理組各種酚類物質(zhì)均顯著下降，且隨水煮時(shí)間延長(zhǎng)而損失越多，水煮1.5 min后檢測(cè)不到QAG。

微波高火3 min處理能使異槲皮素和紫云英苷含量顯著升高至10.95 μg/100 g和6.88 μg/100 g，蘆丁含量無顯著變化，綠原酸、QMG、KMG顯著降低，說明桑葉在微波加熱過程中部分QMG和KMG降解成了異槲皮素和紫云英苷。微波低火處理5 min所有酚類物質(zhì)顯著下降，樣品中已檢測(cè)不到綠原酸、KMG和KAG等成分。

油炸處理后桑葉酚類物質(zhì)組成結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，與凍干比較，油炸桑葉樣品中未檢測(cè)到KMG，而檢測(cè)出KAG、槲皮素和山柰酚。油炸1.5 min桑葉KAG、槲皮素和山柰酚含量分別為1.29、2.00 μg/100 g和0.78 μg/100 g。3 個(gè)油炸處理組之間KAG隨油炸時(shí)間延長(zhǎng)而含量降低，槲皮素和山柰酚含量在油炸2.5 min時(shí)降低，3.5 min時(shí)又有所升高。推測(cè)在油炸處理時(shí)KMG極不穩(wěn)定，易降解成KAG，而QAG和KAG很快又會(huì)降解成槲皮素和山柰酚苷元。

3 結(jié) 論

不同烹飪方式對(duì)桑葉活性成分含量影響顯著，各種烹飪方式都導(dǎo)致DNJ含量降低，DNJ含量從高到低為蒸＞微波＞水煮＞油炸。蒸3 min使桑葉總酚含量增加，其他烹飪處理后總酚含量降低，低火微波5 min桑葉酚類物質(zhì)含量最低。水煮和油炸時(shí)間越長(zhǎng)，桑葉DNJ和總酚含量越低。高效液相色譜-質(zhì)譜分析結(jié)果顯示不同烹飪方式處理后桑葉的酚類物質(zhì)組成有顯著性差異，其中油炸處理對(duì)其成分影響最為顯著，油炸會(huì)使桑葉中的槲皮素和山柰酚糖苷降解為相應(yīng)的苷元。而且油炸桑葉皺縮苦澀，口感不佳，漂燙和蒸制處理的桑葉能較好保證桑葉原有的色、香、味。綜上所述，蒸制是保留桑葉活性成分較好的方法，而水煮、微波和油炸等處理方式要盡量控制短時(shí)間。不同烹飪處理對(duì)桑葉中維生素、蛋白、糖等營養(yǎng)成分的影響還有待于進(jìn)一步研究。