烏日汗，包連勝，包秀萍，李 爽，王歆遠，賈士儒*

（1.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.內蒙古民族大學生命科學學院，內蒙古 通遼 028043；3.內蒙古民族大學附屬醫院康復保健醫院，內蒙古 通遼 028000）

自古以來，飲食療法在蒙醫學中占據重要地位，而酸馬奶是最早應用于食療的飲料[1]。蒙古人釀制酸馬奶的技術和用其治療疾病之事，早在元代即已馳名國內外，亦有元代以前給受傷大出血昏厥的人喝酸馬奶以救治的記載[2]。據文獻報道，酸馬奶對結核病為主的傳染性疾病、消化系統疾病、心血管系統疾病等均有明顯的輔助治療作用[3-6]。因此，目前俄羅斯、蒙古國和我國內蒙古地區還專門設立了“酸馬奶醫療中心”，用其治療或輔助治療消化系統病、心血管系統病等慢性疾病[7]。酸馬奶的這些治療作用與其化學成分、菌群結構等密切相關。酸馬奶是以新鮮馬奶為原料，經乳酸菌和酵母菌等微生物共同發酵而成的。酸馬奶的化學組成不僅取決于原料馬奶，也與其微生物組成及含量有密切關系。群落結構除受到發酵溫度、發酵時間等因素的影響以外，發酵引子也是非常重要的影響因素，發酵引子的組成、品質和活力與酸馬奶質量的好壞、風味特點等有密切關系。酸馬奶的發酵引子蒙語稱為“horongo”，是延續酸馬奶質量的關鍵，因此了解酸馬奶發酵引子的化學組成及微生物多樣性至關重要。以往對于某種體系微生物多樣性的測定多采用傳統分類鑒定方法，但此種方法有選擇性和局限性，因自然界中絕大部分微生物仍處于無法培養狀態。隨著分子生物學手段應用于微生物群落結構分析，彌補了傳統分類學方法的不足，大大促進了對環境中不可培養微生物的研究[8]，尤其是Illumina MiSeq為代表的第2代測序技術，采用邊合成邊測序原理，不僅可以對不同樣品的多個可變區同時進行測序，而且擁有較高的測序速度和通量，結果可信度也較高[9]。目前該測序技術在微生物多樣性和群落結構分析方面已經獲得廣泛的應用，但利用該技術在酸馬奶群落結構方面的研究尚鮮見報道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸馬奶引子：取自內蒙古通遼市科爾沁區食療用酸馬奶生產地的3 個平行樣品（命名為酸馬奶引子-1、酸馬奶引子-2、酸馬奶引子-3），測定pH值后分別裝入采樣管中封口，立即在液氮中冷凍后帶回實驗室保存于-80 ℃，進行后續實驗。

FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒 美國MP Biomedicals公司；Agencourt AMPure XP核酸純化磁珠美國Beckman Coulter公司；TopTaq DNA Polymerase kit北京全式金生物公司。

1.2 儀器與設備

PHS-3C pH計 上海儀電科學儀器公司；1260液相色譜系統、7890A氣相色譜儀、2100生物分析儀美國Agilent公司；NanoDrop 2000分光光度計、Invitrogen Qubit 3.0分光光度計、ABI 2720 Thermal Cycler擴增儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；MiSeq臺式測序儀 美國Illumina公司；5810R高速冷凍離心機德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 化學成分分析

1.3.1.1 乳糖、半乳糖和葡萄糖含量的測定[8]

將凍存的酸馬奶引子樣品在室溫下融化后搖勻，稱取0.4 g該樣品，與1.2 mL超純水混合均勻，超聲波處理3 min，以105 ℃高壓處理15 min，再經4 ℃、4 500 r/min離心10 min。取上清液經0.22 μm膜過濾后進入Agilent 1260液相色譜系統（Bio-Rad HPX-87H離子交換柱（300 mm×7.8 mm）），使用示差檢測器檢測。流動相為5 mmol/L硫酸溶液，流速0.6 mL/min，柱溫60 ℃，進樣量20 μL，18 min停止。

1.3.1.2 有機酸含量的測定

將凍存的酸馬奶引子樣品在室溫下融化搖勻，稱取1.0 g樣品，與3 mL 1 mol/L的鹽酸振蕩混勻，12 000 r/min離心15 min，吸取上清液經0.22 μm濾膜過濾后進入1260液相色譜系統分析。流動相為5 mmol/L的硫酸，流速0.6 mL/min，示差檢測器檢測，柱溫60 ℃，進樣量20 μL，25 min停止。

1.3.1.3 游離脂肪酸含量的測定[10]

脂肪的提取：將凍存樣品室溫融化搖勻，取1 mL樣品加入1.5 mL氯仿-甲醇溶液（2∶1，V/V），25 ℃浸提3 h，加入0.9%氯化鈉溶液靜置分層，收集下層氯仿層氮吹濃縮。

脂肪酸甲酯化：在脂肪提取物中加入2 mL正己烷搖勻，加入2 mL 14%三氟化硼-甲醇，50 ℃水浴5 min，再加入飽和氯化鈉溶液至10 mL，離心取上清液，經0.45 μm濾膜過濾后進行分析。

氣相色譜檢測：采用配有氫火焰檢測器的7890A氣相色譜儀（HP-innowax（30 m×0.32 mm，0.5 μm））進行檢測。載氣為氮氣，恒壓：線速率38.4 cm/s；進樣口溫度270 ℃，進樣體積1 μL，分流比20∶1；柱溫箱溫度：初始50 ℃保持2 min，以25 ℃/min的升溫速率升溫到175 ℃，以3.5 ℃/min的升溫速率升溫到230 ℃，保持5 min；檢測器溫度280 ℃，氣體設置為氫氣40 mL/min、空氣450 mL/min、尾吹氣30 mL/min。

1.3.2 細菌多樣性分析

1.3.2.1 宏基因組DNA的提取

將各酸馬奶引子樣品在室溫充分融化，按照FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒說明書抽提基因組DNA，并使用Nanodrop 2000檢測其質量（質量濃度≥20 ng/μL，總量≥500 ng，OD260nm/OD280nm=1.8～2.0），同時利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。

1.3.2.2 目的區域擴增

以提取的基因組DNA為模板，使用16S rDNA V3-V4區特異引物341F（5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’）和805R（5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’），并采用高效和高保真酶（TopTaq DNA Polymerase kit）進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，設置3 個重復實驗，擴增條件為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性20 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共進行25 個循環；最后72 ℃延伸10 min。

1.3.2.3 PCR產物的混樣和純化

PCR產物使用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；將同一樣本的3 個平行擴增產物混合，每個樣本加入等體積的Agencourt AMpure XP核酸純化磁珠對產物進行純化。

1.3.2.4 各樣本添加特異性標簽序列

利用帶有Index序列的引物，通過高保真PCR向文庫末端引入特異性標簽序列。此處采用8 個循環數的PCR程序。擴增后的產物利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用核酸純化磁珠對擴增產物進行純化，即可得到各樣本的原始文庫。

1.3.2.5 文庫進行定量及混合

將上一步得到的純化產物利用1%瓊脂糖凝膠進行初步定量，根據其結果對已經帶有各自Index標簽的樣本文庫濃度進行適當稀釋，后利用Qubit對文庫進行精確定量，根據不同樣品的測序通量要求，按相應比例混合樣品，后采用MiSeq平臺，2×250 bp的雙端測序策略對文庫進行測序，后續進行生物信息學分析。測序及生物信息服務由上海天昊生物科技有限公司完成。

1.3.2.6 生物信息學分析

測序得到的原始數據（Raw Data），存在一定比例的干擾數據（Dirty Data）。為得到高質量的測序數據，以提高后續生物信息分析準確性、可靠性，首先對原始數據進行拼接、過濾，得到質量和可信度較高的優化序列（Clean reads），然后對優化序列在97%水平上進行可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類，并使用mothur軟件將每條OTU代表序列與數據庫進行比對從而完成OTU的物種注釋。通過對OTU進行豐度、Alpha多樣性以及物種在各個分類水平上的群落結果統計分析，得到細菌群落結構組成。

2 結果與分析

2.1 化學組成分析結果

圖1 酸馬奶引子樣品中糖含量Fig. 1 Sugar content of koumiss starter culture

圖2 酸馬奶引子樣品中4 種有機酸含量Fig. 2 Contents of organic acids in koumiss starter culture

該酸馬奶引子樣品pH值為3.54；糖含量檢測結果顯示（圖1），該酸馬奶發酵引子中乳糖和半乳糖質量分數分別為（0.281±0.011）%和（0.100±0.003）%，未檢測到葡萄糖。此外，檢測的4 種有機酸（圖2）中，乳酸質量分數最高，為（1.506±0.069）%；其次為丁酸（1.143±0.061）%，乙酸和丙酸質量分數分別為（0.345±0.014）%、（0.053±0.002）%。

表1 酸馬奶引子樣品中脂肪酸組成及含量Table 1 Fatty acid composition of koumiss starter culture mg/L

表1顯示，共檢測到19 種脂肪酸，包括12 種飽和脂肪酸和7 種不飽和脂肪酸。飽和脂肪酸中丁酸（C4：0）質量濃度最高，為（78.73±1.36）mg/L；其次為癸酸（C10：0），質量濃度為（18.82±1.03）mg/L。檢測到的7 種不飽和脂肪酸中，包括十四碳烯酸（C14：1）、棕櫚油酸（C16：1）、油酸（C18：1n9c）3 種單不飽和脂肪酸和亞油酸（C18：2n6c）、γ-亞麻酸（C18：3n6）、α-亞麻酸（C18：3n3）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）（C22：6n3）4 種多不飽和脂肪酸。多不飽和脂肪酸中α-亞麻酸（C18：3n3）質量濃度高達（14.12±0.36）mg/L。

2.2 細菌多樣性分析

2.2.1 序列豐度和多樣性

表2 樣品信息、序列豐度和多樣性指數統計Table 2 Sample information, sequence abundance and microbial diversity of koumiss starter culture

通過Illumina MiSeq第2代測序技術，納入本研究的3 個樣品共產生230 091 條原始序列，經過質控和過濾后共得到186 248 條高質量優化序列，各樣本所產生序列數見表2，該酸馬奶引子樣品平均獲得62 082.7 條優化序列。將所得優化序列以97%的相似性進行聚類，相似度大于97%的序列將聚為同一個OTU，同時使用de novo模式去除嵌合體序列，最終產生34.3 個OTU，每個樣品OTU聚類后使用mothur軟件找出與OTU序列相似度最高且可信度達80%以上的物種信息用于OTU注釋。該酸馬奶引子樣品可以注釋到1 個界、4 個門、8 個綱、13 個目、22 個科、25 個屬和28 個種，各分類水平上的OTU數目見表3。

表3 各分類水平上的OTU數目統計Table 3 Statistics of the numbers of OTUs at each taxonomic level

2.2.2 Alpha多樣性分析

圖3 樣品的細菌稀疏曲線圖Fig. 3 Rarefaction analysis of the pyrosequencing reads in samples of koumiss starter culture

圖4 樣品的Shannon-Wiener曲線Fig. 4 Shannon-Wiener index curve of samples of koumiss starter culture

圖5 樣品的Rank Abundance曲線Fig. 5 Rank Abundance distribution curve of samples of koumiss starter culture

該樣本菌群豐富度指數Chao1指數和ACE指數分別為35.2±3.3和35.4±2.9（表2）；樣本的稀釋性曲線如圖3所示，該曲線隨著抽取序列數的增加而趨于平緩，說明樣本的測序數據量合理，更多的數據量只會產生少量新的OTU。但Shannon多樣性曲線已經飽和，如圖4所示，說明即使再增加測序量，樣本微生物的多樣性已經不再隨之發生變化，該測序數據量可以反映樣本絕大多數的微生物信息。從圖5可知，Rank Abundance曲線在橫坐標上的范圍較大且整體較平滑，表明其物種的豐度較高且物種的分布較均勻。

2.2.3 群落結構分析

該酸馬奶引子樣品鑒定為4 個門，分別為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes），其中厚壁菌門在樣品中的含量最高（88.75%），其次為變形菌門（11.12%）（圖5A）；從綱的分類水平來看（圖5B），酸馬奶發酵引子細菌在芽孢桿菌綱（Bacilli，88.74%）、α-變形桿菌綱（Alphaproteobacteria，9.87%）、γ-變形桿菌綱（Gammaproteobacteria，1.25%）中均有分布；從目的分類水平來看（圖5C），酸馬奶發酵引子細菌主要在乳酸桿菌目（Lactobacillales，88.74%）和紅螺菌目（Rhodospirillales，9.84%）有分布；在科的分類水平上，該樣品細菌主要在乳桿菌科（Lactobacillaceae，84.08%）、醋桿菌科（Acetobacteraceae，9.84%）和鏈球菌科（Streptococcaceae，4.59%）有分布；在屬的分類水平上，如圖5E所示，相對豐度由大到小依次為乳桿菌屬（Lactobacillus，84.08%）、醋桿菌屬（Acetobacter，9.83%）、乳球菌屬（Lactococcus，2.41%）、鏈球菌屬（Streptococcus，2.18%）、其他（others，1.5%）。由此可見，乳酸桿菌屬為該酸馬奶引子樣品的絕對優勢種群。

圖6 樣品中菌群相對豐度Fig. 6 Relative abundances of bacteria in samples of koumiss starter culture at various taxonomic levels

3 討 論

酸馬奶口味存在地區差異，這種差異可由發酵引子延續。因為酸馬奶的發酵引子即為發酵結束后留存的酸馬奶，可采用不同的方法保存至下一次發酵，本研究酸馬奶引子樣品為該地區食療用酸馬奶釀制方將發酵結束后的酸馬奶在罐中冷藏保存。酸馬奶引子是專屬的，不僅是酸馬奶發酵的基礎，也可代表該地區酸馬奶的基本特點。

大多數成年人由于缺乏乳糖酶或乳糖酶活力低而不能消化利用乳糖，導致乳糖不耐癥，表現為腸胃氣脹、腹痛和腹瀉[11-12]。鮮馬乳中所含的糖類物質幾乎全為乳糖，且比牛乳的含量高出20%之多[13]。孫天松等[7]檢測新疆地區28 個酸馬奶樣品化學組成，結果顯示其乳糖質量濃度為1.34～3.4 g/100 mL。蒙古國酸馬奶的乳糖質量分數平均為2.3%（發酵時間18 h），前蘇聯酸馬奶的乳糖質量分數為2.6%（發酵時間24 h）[14]。鮮馬乳中乳糖含量降低是由于鮮馬乳中的乳糖在乳酸菌的作用下，通過半乳糖苷透過酶和磷酸轉移酶的作用進入細胞，然后由β-半乳糖苷酶水解成一分子的葡萄糖和一分子的半乳糖。本研究酸馬奶引子樣品中乳糖含量僅為（0.281±0.011）%，低于上述研究結果，該結果證明，酸馬奶發酵結束，保存引子的過程中此反應雖然緩慢，但仍在繼續。因此酸馬奶非常適合于乳糖不耐癥患者飲用。

馬乳中的乳糖在乳酸菌和酵母菌的作用下降解，產生大量以乳酸為主的有機酸，使得其pH值下降。布仁其其格等[15]對內蒙古錫林郭勒盟正鑲黃旗農戶家酸馬奶發酵過程進行檢測，pH值最低達到3.54。孫天松等[7]對新疆維吾爾自治區不同地區28 份酸馬奶樣品測定的pH值為3.47～4.56。Ishii[16]對蒙古國游牧民族3 個地區的酸馬奶進行了測定，pH值為3.7～3.9。本研究中酸馬奶引子樣品pH值為3.54，處于較低水平。酸馬奶pH值受到微生物組成、環境、氣候、發酵溫度和發酵時間等因素的影響而產生一定差異。

有機酸不僅是酸乳中乳糖代謝的中間產物，又是形成某些風味物質的前體物。本研究檢測的4 種有機酸中，乳酸質量分數最高，為（1.506±0.069）%。在發酵乳的生產中乳酸起著非常重要的作用，它不僅是導致pH值降低的主要原因，也是酸乳濃厚的風味和香味的來源之一[17]。本樣品中丁酸含量僅次于乳酸。據臨床數據顯示，胃排空延遲為常見疾病，尤其多發于功能性消化不良、糖尿病性或者特發性胃輕癱等患者，主要表現為胃飽脹感、腹痛、腹脹、惡心、嘔吐等[18-23]。丁酸可以特異性的通過GPR43受體促進任何小鼠gastroid中產ghrelin內分泌細胞的分化，從而增加胃的三相收縮促進胃排空[24]。

酸乳制備過程中，乳脂類的酶促水解反應最終產生游離脂肪酸和甘油。此外，乳糖代謝、氨基酸脫氨基和脂類氧化等都可能形成游離脂肪酸。本研究共檢測出19 種脂肪酸，包括12 種飽和脂肪酸和7 種不飽和脂肪酸。不飽和脂肪酸中的多不飽和脂肪酸是人體必需的脂肪酸，具有諸多生理功能，例如調節血脂、改善血液循環、防止動脈粥樣硬化和血栓形成等[25-26]。但多不飽和脂肪酸機體自身不能合成，必需由食物供給。本樣品檢測出4 種多不飽和脂肪酸，分別為亞油酸（C18：2）、α-亞麻酸（C18：3n3）、γ-亞麻酸（C18：3n6）和DHA（C22：6n3）。

酸馬奶發酵的特有風味和營養價值是由微生物之間的共同作用促成的。酸馬奶中微生物的多樣性極其豐富。多年來，在酸馬奶微生物多樣性的研究中，多采用傳統分類鑒定方法。孫天松等[27]采用此方法從新疆地區30 份酸馬奶中共分離到152 株乳酸菌，其中Lactobacillus helveticus占51.3%，Lactobacillus acidophilus占18.4%，Lactobacillus casei subsp. pseudoplantarum占8.6%。Ring等[28]也采用傳統培養方式鑒定蒙古國酸馬奶中乳酸菌的多樣性，結果發現乳桿菌屬是酸馬奶中的優勢菌群，同時也檢測到了嗜熱鏈球菌、拉烏爾菌屬、嗜冷桿菌屬等。由于該種方法的局限性，同時隨著分子生物學的不斷發展，高通量測序技術自2006年開始廣泛應用于微生物群落結構分析領域。布仁其其格[8]采用454焦磷酸高通量測序技術，對內蒙古錫林郭勒盟酸馬奶發酵過程中細菌群落結構動態變化進行了測定，其結果顯示酸馬奶發酵過程中存在豐富的細菌多樣性，而且乳桿菌屬為優勢細菌屬，占51.06%，乳球菌屬為其次的優勢菌屬，占30.29%。本研究利用Illumina MiSeq第2代測序技術鑒定內蒙古科爾沁地區酸馬奶引子樣品細菌多樣性，其結果顯示，乳桿菌屬為該樣品絕對優勢種群，占84.08%之多。此值明顯高于以上研究結果，分析其可能的原因：1）Illumina MiSeq高通量測序技術覆蓋深度非常大，對物種多樣性的分析十分有利，因此該技術不僅可作為全面、客觀地揭示特定環境中群落結構的有效途徑，同時也可作為更深層次挖掘有益微生物資源的有效手段；2）酸馬奶引子在保存過程中，隨著pH值的持續下降，其他菌屬無法承受如此酸性環境而降解，但乳桿菌屬因其更強的耐酸性，持續繁殖，繼而占據絕對優勢。目前，益生菌受到人們越來越多的關注。根據聯合國糧食及農業組織和世界衛生組織益生菌的定義，益生菌是一種食用者攝取適當量后，能對食用者健康發揮有益作用的活菌[29]。益生菌通常由食物攜帶或以制劑形式口服，若要發揮其生理功能，必需要耐受胃酸而活著到達腸道[30-31]。因此作為益生菌，應當具備一些生物學特性，例如耐酸性。本研究中，酸馬奶引子樣品pH值低至3.54，且仍有大量的乳桿菌屬存活，因此該酸馬奶引子樣品可作為優良益生菌的珍貴來源。

4 結 論

本研究對內蒙古科爾沁地區酸馬奶引子樣品化學成分和細菌多樣性進行分析?；瘜W成分測定結果表明，該酸馬奶樣品pH值為3.54，乳糖、半乳糖均較低，未檢測到葡萄糖；4 種有機酸中乳酸含量最高，其次為丁酸；共檢測12 種飽和脂肪酸和7 種不飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸中α-亞麻酸含量最高。細菌多樣性分析結果表明，該樣品中細菌主要分布于4 個屬，分別為乳桿菌屬（Lactobacillus）、醋桿菌屬（Acetobacter）、乳球菌屬（Lactococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）；乳桿菌屬為其絕對優勢菌屬。

該酸馬奶引子樣品不僅含有較高水平的α-亞麻酸，且含有相對含量高達84.08%、耐酸能力較強的乳桿菌屬，因此可作為優良的微生物資源，用于乳酸桿菌屬、乳球菌屬等益生菌的分離和篩選。