莫加利，陳季旺,2,3,*，劉靜泊，舒 靜,2，廖 鄂,2,3，夏文水,3，程水源,4

（1.武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023；2.農產品加工與轉化湖北省重點實驗室（武漢輕工大學），湖北 武漢 430023；3.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；4.國家富硒農產品加工技術研發專業中心，湖北 武漢 430023）

風干武昌魚是通過自然風干腌制武昌魚制作的一種發酵魚，是長江中下游地區的一種傳統風味魚制品[1]。通過酶和微生物的作用，魚肉中的蛋白質、脂肪和碳水化合物在腌制和風干過程發生降解，形成風干武昌魚特有的風味。此外，風干武昌魚中游離氨基酸種類齊全，富含二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，深受消費者喜愛[2]。

鮮味肽是指從食物中提取或者由氨基酸合成的低分子質量的肽，不僅能賦予食品特殊的滋味，而且能改善風味，提升味感[3-6]。科研人員從各種食品及動植物蛋白酶解物中已分離和鑒定了大量的鮮味肽，并研究了這些鮮味肽的結構與鮮味的關系[7-15]。超濾、凝膠過濾色譜、反相高效液相色譜（reversed phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）常用于分離和純化鮮味肽，基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜（matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）和傅里葉變換紅外光譜（Fourier translation infrared spectroscopy，FTIR）等可用于測定鮮味肽的分子質量和結構[4-5,9-14]。電子舌是基于非選擇性電化學傳感器陣列結合化學計量學的方法建立起來的檢測體系。作為一種分析、識別和檢測復雜呈味物質的儀器，電子舌具有快速、簡便、安全、無疲勞等特點，廣泛應用于食品領域[16-17]。

本課題組分析了風干武昌魚的灰分、脂肪、蛋白質和多肽含量、氨基酸和脂肪酸組成及揮發性成分[18]。有關風干武昌魚中鮮味肽的分離純化和結構分析的研究鮮見報道。因此，本實驗采用電子舌測定鮮味，以及超納濾、RP-HPLC從風干武昌魚中分離純化出純度均一的鮮味肽，MALDI-TOF-MS、氨基酸自動分析儀、FTIR測定鮮味肽的分子質量、氨基酸組成和二級結構，探討鮮味肽結構與風味的關系，以為風干武昌魚的標準化生產提供科學指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

風干武昌魚（每條魚質量約為258 g，水分40.64%、蛋白質32.72%、脂肪9.40%、灰分9.38%、多肽4.26%）湖北興興食品有限公司；三氟乙酸（色譜純） 美國Sigma公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、溴化鉀（分析純）、正己烷（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

LG-3型冷凍干燥機 寧波市生化儀器廠；TS-5000Z電子舌 日本Insent公司；1500 HPLC儀 美國SSI公司；1525-2489 HPLC儀 美國Waters公司；HPS-3超濾膜、卷式芳香聚酰胺納濾膜 上海摩速有限公司；MALDI-TOF-MS儀 日本島津公司；NEXUS 670型FTIR儀 美國尼高力儀器公司；L-8900氨基酸自動分析儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 風干武昌魚水溶性蛋白的提取

將風干武昌魚去骨后用刀切成塊狀，加入去離子水，于勻漿機中12 000 r/min勻漿5 min，打碎混勻冷凍干燥后粉碎。取粉碎的魚肉100 g，正己烷脫脂后加入去離子水，在魚肉與水的比例1∶10（g/mL），溫度40 ℃，時間120 min條件下提取，4 000 r/min離心15 min，取上清液，真空濃縮、冷凍干燥，制得風干武昌魚水溶性蛋白，-18 ℃冷凍貯藏，備用。

1.3.2 超濾預分離、納濾脫鹽

室溫下使操作壓力為0.1 MPa，將風干武昌魚水溶性蛋白用超純水配成1 mg/mL的溶液100 mL，通過截留分子質量3 kDa的超濾膜進行超濾分離，收集濾過液和截留液，真空濃縮、冷凍干燥，-18 ℃冷凍貯藏，備用；室溫下使操作壓力為0.5 MPa，將電子舌測得超濾后鮮味較佳的組分用超純水配成1 mg/mL的溶液100 mL，通過截留分子質量約200 Da的納濾膜進行納濾脫鹽，收集截留液，真空濃縮、冷凍干燥，制得納濾脫鹽組分，-18 ℃冷凍貯藏，備用。

1.3.3 鮮味肽的理化成分測定

水分含量測定：參照GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》105 ℃恒重法[19]；灰分含量測定：參照GB 5009.4—2016《食品中灰分的測定》550～600 ℃灰化法[20]；蛋白質含量測定：參照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》凱氏定氮法，轉換系數采用6.25[21]。

肽含量測定：采用雙縮脲法[22]。分別取4 mg超濾前水溶性蛋白、4 mg超濾后鮮味較強（未納濾）水溶性蛋白、4 mg納濾脫鹽水溶性蛋白置于試管中，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，于旋渦混合儀上混合均勻，靜置10 min，然后4 000 r/min離心15 min。將上清液全部轉移到50 mL容量瓶中并用5%的三氯乙酸溶液定容，搖勻。取6 mL上述溶液置于另一試管中，加入雙縮脲試劑4 mL（樣液∶雙縮脲試劑=3∶2，V/V），于旋渦混合儀上混合均勻，靜置10 min后2 000 r/min離心10 min。取上清液于波長540 nm處測定吸光度，參照標準曲線，計算超濾前組分、超濾后鮮味較強（未納濾）組分、納濾脫鹽組分中的多肽含量。

標準曲線的繪制參照雙縮脲法-常量法[22]。準確稱取10 mg酪蛋白，以0.05 mol/L氫氧化鈉溶液配制成質量濃度約為5 mg/mL的蛋白質標準溶液，分別取出0、1、2、3、4、5 mL轉入6 支比色管，各加入4 mL雙縮脲試劑，并分別加入超純水補足到20 mL，于波長550 nm處比色，繪制標準曲線。

理化成分含量均按超濾前組分、超濾后鮮味較強（未納濾）組分、納濾脫鹽組分質量計。結果以干基計。

1.3.4 RP-HPLC純化鮮味肽

選用超納濾分離得到的鮮味較強的肽組分，采用RP-HPLC進一步純化，收集各組分，經真空濃縮、冷凍干燥，-18 ℃冷凍貯藏，備用。

RP-HPLC純化條件：SSI 1500 HPLC系統；Jupiter C18色譜柱（250 mm×10 mm）；SSI 1500紫外檢測器，波長220 nm；流動相A：0.1%三氟乙酸溶液；流動相B：0.1%三氟乙酸-乙腈溶液；流速2 mL/min；樣品質量濃度10 mg/mL；進樣體積1 mL；線性洗脫梯度：0～5 min，5% A；5～18 min，5%～15% A；18～20 min，15%～5% A。

1.3.5 電子舌分析

參照Zhang Meixiu等[14]的方法稍作改進。分別將RP-HPLC純化的肽組分和超濾分離、納濾脫鹽的肽組分用超純水配成1 mg/mL的溶液80 mL，電子舌分析其滋味，選取鮮味較強的組分。

1.3.6 鮮味肽的純度鑒定

采用RP-HPLC鑒定鮮味較強的肽組分的純度，色譜條件如下：1525 HPLC系統；Jupiter C18色譜柱（250 mm×4.6 mm）；Waters 1489紫外檢測器，波長220 nm；流動相A：0.1%三氟乙酸溶液；流動相B：0.1%三氟乙酸-乙腈溶液；流速1 mL/min；樣品質量濃度10 mg/mL；進樣體積20 μL；線性洗脫梯度：0～2 min，5% A；2～10 min，5%～15% A；10～12 min，15%～5% A。

1.3.7 MALDI-TOF-MS測定分子質量

樣品制備：稱取約20 mg純化的肽組分，溶于100 μL水中。用20%乙腈溶液稀釋50 倍后，取0.5 μL點樣，進行MALDI-TOF測試。

點樣：取1 μL供試品點至樣品靶上，自然干燥后，再取0.6 μL α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA）基質溶液點至對應靶位上并自然干燥，用相同方法在樣品靶位相鄰位置點標準品。

校準：在正離子模式下選擇反射方法對樣品測試范圍進行校準測試。標準物質校準范圍為：1 046.542±0.5、1 533.858±0.5、2 465.199±0.5、3 494.651±0.5。

測試樣品：在正離子模式下選擇線性方法測試樣品分子質量。

質譜數據及圖譜處理：5800 MALDI-TOF/TOF產生的原始數據及圖譜由4000 Series Explorer V3.5軟件導出。

1.3.8 氨基酸組成分析

采用氨基酸自動分析儀測定純化肽組分的氨基酸組成。取一定量的純化肽組分于玻璃試管中，加入15 mL 6 mol/L HCl溶液，試管抽真空，充氮氣封管，置于108 ℃恒溫干燥箱內水解24 h，待冷卻后，過濾，定容至100 mL，吸取濾液20 μL于40 ℃真空干燥器中進行干燥，用0.2 mol/L HCl溶液定容至1 mL，用氨基酸自動分析儀測定。結果以濕基計。

1.3.9 FTIR分析

參照Hasni等[23]的方法稍作改進。采用FTIR分析純化肽組分的二級結構。用蘸取無水乙醇的脫脂棉將鑷子、研缽、壓片等用具擦試干凈，放在紅外燈下照射使無水乙醇快速揮發。在研缽中加入適量溴化鉀，按照質量比約1∶100加入純化的肽組分，充分研磨至粉末狀混勻，壓片（壓片盡量薄而透明，以保證較高的透光率）。用FTIR測定紅外吸收光譜圖，以溴化鉀粉末作為空白背景，設定分辨率4 cm-1，掃描次數16 次，做全波長（500～4 000 cm-1）掃描。

1.4 數據處理

采用Microsoft Office Excel 2010軟件和SPSS 19.0進行數據處理，結果以 ±s表示。實驗至少重復3 次，取其平均值。

2 結果與分析

2.1 超濾分離組分的電子舌分析

圖1 超濾組分的電子舌雷達圖Fig. 1 Electronic tongue radar chart for the taste of ultrafiltration fractions

采用截留分子質量為3 kDa的超濾膜對風干武昌魚水溶性蛋白進行分離，得到分子質量大于3 kDa、小于3 kDa 2 種組分，分別命名為P1、P2。電子舌分析超濾前組分、P1、P2的滋味，結果見圖1。從圖1可以看出，超濾前組分鮮味比P1強，因為超濾前水溶性成分中有機酸、核酸及其他代謝產物，例如核苷酸、核糖等，對鮮味也有貢獻[24-27]。分子質量小于3 kDa的組分（P2）鮮味較大于3 kDa的組分（P1）強，這與Lioea[28]、Claeys[29]等報道的風味肽主要是分子質量小于3 kDa的肽一致。因此，選取P2進行納濾脫鹽及進一步純化。

2.2 超濾、納濾組分的成分

表1 超濾、納濾肽組分的主要成分Table 1 Components of ultrafiltration and nano-filtration fractions%

將P2納濾脫鹽后得到組分P2a。由表1可知，超濾后組分（P2）中肽質量分數由16.65%增加至50.77%，高分子質量的蛋白質、多肽等被截留，低分子質量的肽被富集。從風干武昌魚中提取的水溶性蛋白中灰分質量分數非常高，達到了19.97%，超濾雖然去除了少量的灰分，但是P2中灰分質量分數仍較高（17.84%），納濾后組分（P2a）中灰分質量分數由17.84%降低至9.82%，納濾脫鹽去除了組分P2中50%的灰分，達到了較好的脫鹽效果。

2.3 RP-HPLC純化鮮味肽

圖2 RP-HPLC純化鮮味肽的色譜圖Fig. 2 Chromatogram of umami peptide purified by using RP-HPLC

由圖2A可知，P2a在保留時間20 min內，線性梯度洗脫得到4 個在波長220 nm有吸收峰的組分，分別標注為P2a-1、P2a-2、P2a-3和P2a-4。由于RP-HPLC分離使疏水性弱（極性強）的物質先被洗脫下來，初步判斷P2a-1、P2a-2的極性較強。分別收集4 個組分，經真空濃縮、冷凍干燥后進行電子舌分析。

從圖2B可以看出，P2a-2在波長220 nm的洗脫圖譜中呈單一峰，純度高達95.20%，可用于進一步的結構分析。

2.4 RP-HPLC純化肽組分的電子舌分析

RP-HPLC純化的4 個組分（P2a-1、P2a-2、P2a-3、P2a-4）和P2a的電子舌分析結果見圖3。從圖3可知，5 個組分鮮味差別較大，P2a-3的鮮味最弱，其次是P2a-4、P2a-1和P2a，RP-HPLC純化的4 個組分中P2a-2鮮味強度最高。因此，選用P2a-2進一步分析。

圖3 RP-HPLC純化鮮味肽的電子舌雷達圖Fig. 3 Electronic tongue radar chart of umami peptide purified by using RP-HPLC

2.5 P2a-2純度鑒定

圖4 P2a-2的MALDI-TOF-MS一級質譜圖Fig. 4 MALDI-TOF-MS spectrum of P2a-2

采用MALDI-TOF-MS測定鮮味肽P2a-2的質量指紋圖譜，結果見圖4。由圖4可知，P2a-2經過激光輻照解離并扣除基質的噪音干擾，在m/z 1 304.590 7出現明顯的峰，雜峰較少，說明P2a-2純度較高，是分子質量1 304.59 Da的肽，與RP-HPLC純度鑒定的結果一致（圖2B）。

2.6 氨基酸組成分析

構成天然蛋白質的氨基酸都屬L型，大部分L型氨基酸及其鹽具有酸味、甜味、苦味及鮮味，對食品風味的形成有重要作用[24,30-32]。如表2所示，P2a、P2a-2的呈味氨基酸比例均較高，分別為71.79%、57.28%。P2a、P2a-2的呈味氨基酸中鮮味氨基酸谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸含量均較高，但是天冬氨酸含量較低。谷氨酸是呈現鮮味的特征酸性氨基酸，可以提供作為鮮味肽助味基的氨基或羥基，是呈現風干武昌魚鮮美口感的重要氨基酸[24,30-32]。P2a-2中谷氨酸含量為21.97%，比P2a低1.3%，然而P2a-2的組氨酸含量（27.54%）比P2a高9.91%。Fuke等[33]研究表明組氨酸能夠增強風味效果，促進水產品鮮香味的形成，初步推斷P2a-2的鮮味比P2a強與組氨酸含量相差較大相關。另外，P2a-2中極性氨基酸組氨酸含量最高，與2.3節純化過程中顯示先被洗脫分離的組分P2a-2極性較強的結果一致。

表2 P2a、P2a-2的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of P2a and P2a-2%

2.7 FTIR分析

圖5 P2a、P2a-2的FTIR分析Fig. 5 FTIR spectra of P2a and P2a-2

如圖5所示，蛋白質和多肽在紅外區域表現為9 個特征振動模式或基團頻率，但只有酰胺I帶（1 700～1 600 cm-1）是對蛋白質結構變化高度敏銳的一個譜帶，常用于二級結構的分析，因此選用酰胺I帶分析P2a、P2a-2二級結構的差異[12,23,34]。酰胺I帶的振動頻率取決于C＝O和H—N之間的氫鍵性質，酰胺I帶的波數在1 610～1 640 cm-1范圍內為β-折疊，1 640～1 650 cm-1范圍內為無規卷曲，1 650～1 658 cm-1范圍內為α-螺旋，1 660～1 695 cm-1范圍內為β-轉角[12,23,34]。P2a、P2a-2各子峰的面積百分比及歸屬見表3。

表3 P2a、P2a-2的二級結構分析Table 3 Analysis of the secondary structures of P2a and P2a-2

由表3可知，P2a二級結構相對含量依次為：β-折疊49.31%、無規卷曲24.28%、α-螺旋20.55%、β-轉角5.86%；P2a-2二級結構相對含量依次為：β-轉角90.16%、α-螺旋9.84%。P2a的二級結構以β-折疊為主，P2a-2的二級結構以β-轉角為主。在蛋白質的二級結構中α-螺旋、β-折疊是常見的規則的二級結構，β-轉角是部分規則的二級結構[24,30]。經常出現在β-轉角中的氨基酸有天冬氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、組氨酸和谷氨酸等，以及影響規則二級結構形成的脯氨酸和甘氨酸[24,30]。脯氨酸的α-碳原子參與R基吡咯的形成，環內的Cα—N鍵和C—N肽鍵都不能旋轉，而且脯氨酸形成的肽鍵不具酰胺氫，不能形成鏈內氫鍵，多肽鏈中只要存在脯氨酸，α-螺旋、β-折疊結構即被中斷。然而，脯氨酸具有的環狀結構和固定的φ角，在一定程度上能促使β-轉角的形成，因此，蛋白質中脯氨酸含量高且分布均勻時，該蛋白的α-螺旋、β-折疊結構缺乏，而β-轉角結構含量較高[24,30]。P2a-2的脯氨酸相對含量是P2a的1.4 倍，明顯高于P2a（表2），且組氨酸、谷氨酸含量均較高，利于β-轉角的形成。經常出現在β-轉角中的谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甘氨酸均屬于鮮味氨基酸，組氨酸屬于鮮味增強氨基酸，有利于P2a-2鮮味的形成，推斷P2a-2呈現鮮味與其二級結構以β-轉角為主相關。

3 結 論

采用超濾分離、納濾脫鹽和RP-HPLC純化從武昌魚肉中純化得鮮味較佳單一肽組分P2a-2，MALDI-TOF-MS測定P2a-2的分子質量為1 304.59 Da。P2a-2的鮮味氨基酸比例較高，二級結構分別以β-轉角為主。經常出現在β-轉角中的谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甘氨酸均屬于鮮味氨基酸，組氨酸屬于鮮味增強氨基酸，有利于P2a-2鮮味的形成，推斷P2a-2呈現較佳鮮味與其鮮味氨基酸含量較高及二級結構以β-轉角為主相關。該研究結果可用于指導風干武昌魚的標準化生產。