ASPE-UPLC-MS/MS測定動物源食品中痕量五氯酚及其鈉鹽

陳彥宏 陳 穗 宋安華 黃景初 陳悅銘 劉 佳 王 宇,

(1.廣州市食品檢驗所，廣東 廣州 511400；2.廣東美味鮮調味食品有限公司，廣東 中山 528437)

五氯酚(pentachlorophenol，PCP)及其鈉鹽屬高毒有機氯農藥，被廣泛應用于防腐、抗菌、殺蟲、除草等方面。中國主要將五氯酚用于吸血蟲中間宿主釘螺的滅殺，稗草的防治，皮革、木材的防腐，以及養殖水體的消毒、清塘等[1]。五氯酚化學性質穩定，不易降解，具有生物蓄積作用，致畸、致癌、致突變等毒副作用，被國際癌癥研究機構IARC列為2B類致癌物[2]。五氯酚鈉具有較好的水溶性，可通過水載體廣泛傳播，進入食物鏈并產生生物蓄積[3]。五氯酚進入高等動物體內，可通過血液參與機體循環，與血液中細胞、功能蛋白等發生作用，抑制生物代謝過程的氧化磷酸化，影響肝、腎、中樞神經等器官、組織的正常生理活動[4]。農業部公告第193號及第235號規定，所有動物源食品中禁止使用五氯酚及其鈉鹽[5-6]，動物性食品中不得檢出。《國家食品安全監督抽檢實施細則(2018年版)》也明確規定畜禽肉及其副產品須檢測五氯酚及其鈉鹽項目[7]。因此，建立靈敏度高、重現性好、可用于確證動物源食品中痕量五氯酚及其鈉鹽殘留的檢測方法顯得尤為重要。

目前，針對五氯酚及其鈉鹽常用的檢測方法有氣相色譜法(GC)[8-10]、氣相色譜—質譜法(GC-MS)[11-13]、液相色譜法(LC)[14-16]、液相色譜—串聯質譜法(LC-MS/MS)[17-19]、免疫分析法[20]等。GC和GC-MS需柱前衍生，操作繁瑣；LC靈敏度不高，定性較差；LC-MS/MS具有靈敏度高、選擇性強等特點，已廣泛運用于動物源食品中獸藥殘留及非法添加物的確證檢測。GB 23200.92—2016為動物源食品中五氯酚的測定提供了依據，但該法規使用基質標準曲線進行定量，當同時檢測多種不同類型樣品時，需配制多條基質標準曲線，基質復雜，操作繁瑣。

本研究擬運用全自動高通量柱式固相萃取系統，在GB 23200.92—2016的基礎上，優化樣品前處理方法，采用內標法定量，研究提取溶液的選擇、固相萃取條件的選擇與優化、內標的選擇等對測定結果的影響，建立顯著降低基質效應、響應度高、定性定量準確的檢測方法，以滿足食品安全監管中大批量實際樣品的測定分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

豬肉、豬肝、雞肉、雞蛋、紅立魚、明蝦、大閘蟹、鮮牛奶：市售；

C18固相萃取柱：500 mg/6 mL，天津博鈉艾杰爾科技有限公司；

Oasis HLB固相萃取柱：200 mg/6 mL，美國Waters公司；

Oasis MAX固相萃取柱：150 mg/6 mL，美國Waters公司。

五氯酚鈉(PCP-Na)標準品：批號Lot 94492，純度86.0%，德國Dr.Ehrenstorfer公司；

五氯酚-13C6(PCP-13C6)標準品：批號Lot M-310，純度99%，加拿大CDN公司；

五溴酚(PBP)標準品：批號Lot 160473，純度99.6%，德國Dr.Ehrenstorfer公司；

乙腈：色譜純，美國Fisher公司；

三乙胺：分析純，德國CNW公司；

氨水、甲酸、鹽酸、乙酸銨：分析純，廣州化學試劑廠；

試驗用水：一級水，經Synergy超純水系統純化的超純水(18.2 MΩ·cm)。

1.1.2 儀器與設備

超高效液相色譜儀：UPLC-30A型，日本Shimadzu公司；

三重四級桿質譜儀：Triple Quad 5500型，美國AB SCIEX公司；

全自動高通量柱式固相萃取系統：SPE1000-8型，美國LabTech公司；

分析天平：UW6200H型，日本Shimadzu公司；

分析天平：CP225D型，德國Sartorius公司；

均質機：T18 digital ULTRA-TURRAX型，德國IKA公司；

旋渦混合器：MS 3 digital型，德國IKA公司；

渦旋振蕩器：Multi Reax型，德國Heidolph公司；

離心機：Allegra X-30R型，美國BECKMAN公司；

氮吹儀：N-EVAP 112型，美國Organomation公司；

超純水系統：Synergy型，德國Merck公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取溶劑的選擇 稱取2.00 g均質豬肉樣品若干份于50 mL離心管，分別使用10 mL乙腈、5%三乙胺乙腈、2%三乙胺的乙腈—水溶液(70∶30，體積比)、5%三乙胺的乙腈—水溶液(70∶30，體積比)、8%三乙胺的乙腈—水溶液(70∶30，體積比)、2%氨水—乙腈、5%氨水—乙腈和8%氨水—乙腈充分提取，均質1 min，旋渦混合5 min，8 000 r/min 離心3 min，收集提取液。

1.2.2 固相萃取條件的確定

(1)固相萃取柱的選擇：使用1.0，5.0，10.0 μg/kg添加水平下的豬肉樣品，比較C18、Oasis HLB和Oasis MAX固相萃取柱的萃取回收率。

(2)洗脫液的選擇：確定使用Oasis MAX固相萃取柱后，比較4%甲酸—甲醇、6%甲酸—甲醇、8%甲酸—甲醇、10%甲酸—甲醇、0.2%鹽酸—甲醇、0.4%鹽酸—甲醇等不同酸度的酸性甲醇溶液的洗脫能力。使用甲醇、水活化Oasis MAX柱，移取5 mL提取液以1 mL/min流速通過固相萃取柱，用5 mL 5%氨水溶液、甲醇、甲酸—甲醇—水溶液(2∶49∶49，體積比)淋洗，氣推抽干，分別使用5 mL 4%甲酸—甲醇、6%甲酸—甲醇、8%甲酸—甲醇、10%甲酸—甲醇、0.2% 鹽酸—甲醇和0.4%鹽酸—甲醇洗脫，收集洗脫液。

(3)定容溶劑的選擇：洗脫液于40 ℃下氮氣吹至近干，分別用水、乙腈和乙腈—水溶液(50∶50，體積比)定容至2.0 mL，經0.22 μm濾膜過濾，供液相色譜—串聯質譜儀測定。

1.2.3 超高效液相色譜—串聯質譜法條件的確定

(1)質譜條件：使用電噴霧電離負離子(ESI-)多反應監測模式(MRM)，氣簾氣(CUR)0.206 9 MPa(即30.0 Psi)，碰撞氣(CAD)0.062 1 MPa(即9.0 Psi)，電噴霧電壓(IS)—4 500 V，離子源溫度(TEM)500 ℃，霧化氣(GS1)0.344 8 MPa(即50.0 Psi)，輔助氣(GS2)0.344 8 MPa (即50.0 Psi)，選定母離子對，優化去簇電壓(DP)、射入電壓(EP)、碰撞電壓(CE)和碰撞室射出電壓(CXP)。

(2)色譜條件：色譜柱為Kinetex C18柱(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)，流速0.3 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量5 μL，以乙腈為流動相A相，比較水、5 mmol/L乙酸銨水溶液和5 mmol/L乙酸銨的0.1%甲酸水溶液為流動相B相時的分離效果，選擇最佳流動相。

(3)基質效應與內標的選擇：配制豬肉、豬肝、雞肉、雞蛋、魚肉、蝦、蟹和牛奶樣品的基質標準曲線，與相應濃度的溶劑標準曲線比較，研究基質效應。基質效應(ME)=[(基質標準曲線的斜率÷溶劑標準曲線的斜率)-1]×100%。比較五氯酚-13C6和五溴酚的性質，選擇合適內標。

1.2.4 方法學考察

(1)線性關系與定量限：使用乙腈—水溶液(50∶50，體積比)逐級稀釋標準儲備液，加入內標，制得0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 μg/L的標準工作溶液，內標濃度1.0 μg/L。以五氯酚與內標的峰面積之比為縱坐標y，濃度為橫坐標x，加權后進行線性回歸。進樣量5 μL，計算目標物峰高與基線噪聲的信噪比(S/N)，以S/N=10為儀器定量限，并測定空白樣品加標回收后的信噪比，確證方法定量限。

(2)準確度與精密度：在豬肉、豬肝、雞肉、雞蛋、魚肉、蝦、蟹和牛奶樣品中各添加1.0，5.0，10.0 μg/kg五氯酚，重復測定6次，計算加標回收率和相對標準偏差(RSD)。

1.3 數據處理

采用Excel 2016進行數據整理、分析，并繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑的確定

由表1可知，提取回收率隨著提取溶劑中堿濃度的增加而增加，當堿濃度增加至一定程度后，回收率趨于穩定，且提取溶劑中含水的提取效果優于不含水的。5%三乙胺的乙腈—水溶液(70∶30，體積比)和5%氨水乙腈提取效率相近，此方法最終選用5%氨水—乙腈進行提取。動物組織內部的五氯酚以結合態存在[21]，提取前需將其水解(加酸或加堿)或酶解成游離態。加堿可調節溶劑pH值，PCP的pKa為4.74[22]，當pH>pKa+2個單位時，PCP發生離子化，呈游離的離子形態。

表1提取溶劑對豬肉加標樣品中五氯酚提取回收率的影響
Table 1Extraction percentage of pentachlorophenol from pork spiked samples by different extraction solvents(5 μg/kg)

提取溶劑回收率/%乙腈64.05%三乙胺—乙腈72.22%三乙胺的乙腈—水溶液76.95%三乙胺的乙腈—水溶液83.28%三乙胺的乙腈—水溶液80.12%氨水—乙腈74.85%氨水—乙腈85.48%氨水—乙腈80.4

2.2 固相萃取條件的確定

2.2.1 固相萃取柱的選擇 由圖1可知，在1.0，5.0，10.0 μg/kg 添加水平下，Oasis MAX柱的萃取回收率最佳，Oasis HLB柱次之，C18柱最差。這是由于C18柱更適合于非極性到中等極性的化合物，對強極性的五氯酚吸附保留效果較弱。HLB柱為親水親脂平衡柱，是適用于酸性、中性和堿性化合物的通用型小柱，對極性化合物的保留需提供較好的水浸潤性環境，對水樣品中五氯酚的回收率較好，但對動物源食品中五氯酚的回收率一般。Oasis MAX柱為一種混合型的陰離子交換柱，其填料為N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯苯共聚物基質-CH2N(CH3)2C4H9。堿性環境下，呈酸性的五氯酚發生離子化，帶電荷，其酚羥基表現為1個負電荷的陰離子，酚羥基與MAX柱填料上表現為1個正電荷陽離子的季銨基發生離子交換作用，使五氯酚被強吸附并保留于MAX柱上[17]。因此，最終選用Oasis MAX固相萃取柱進行凈化。

圖1 固相萃取柱對豬肉中五氯酚萃取回收率的影響Figure 1 Extraction percentage of pentachlorophenol from pork by different solid phase extraction columns

2.2.2 洗脫液的選擇與優化 由圖2可知，隨著甲酸濃度的增加，洗脫液的洗脫能力逐漸增強。鹽酸的酸度強于甲酸，洗脫液中加入微量鹽酸同樣可實現五氯酚的洗脫，但由于鹽酸酸度過強，洗脫下部分強吸附的干擾物質，基質干擾加重，影響回收率。因此，最終選用10%甲酸—甲醇進行洗脫。

使用酸性甲醇洗脫，主要是利用其酸性pH可中和被吸附的陰離子，使其去離子化，不再與填料上的季銨基產生靜電吸引。當pKa-2個單位

圖2 酸性甲醇溶液濃度對五氯酚洗脫能力的影響Figure 2 Elution ability of acid methanol solution with different acid concentration on pentachlorophenol

2.2.3 定容溶液的選擇與優化 分別使用水、乙腈和乙腈—水溶液(50∶50，體積比)定容，發現水中未檢測到目標物五氯酚；乙腈中五氯酚峰型較差，出現溶劑效應；乙腈—水溶液(50∶50，體積比)中五氯酚峰型良好。因此，最終選用乙腈—水溶液(50∶50，體積比)進行定容。五氯酚鈉水溶液經酸化至pH為6.6～6.8時，將全部轉化為五氯酚析出[3]。MAX固相萃取時，酸性甲醇洗脫液已使五氯酚鈉轉化為五氯酚。五氯酚鈉易溶于水，而分子形態的五氯酚難溶于水，可溶于多數有機溶劑。

2.3 超高效液相色譜—串聯質譜法條件的確定

2.3.1 質譜條件的確定 五氯酚是一種氯代酚類物質。五氯酚所含苯環中存在共軛雙鍵，使π鍵電子云完全平均化，每個碳—碳鍵的鍵長和鍵能均相等，故五氯酚具有較強的穩定性。五氯酚分子離子([M-H]-)在三重四級桿碰撞室內不易被打碎，當碰撞能量(CE)增加至較大程度也只能使母離子裂解出1個[Cl]-，較難獲得特征子離子，如圖3所示。

圖3 五氯酚m/z 262.8離子的產物離子掃描質譜圖Figure 3 Production scanning mass spectrum of pentachlorophenol m/z 262.8 ion (CE -40 V)

因此，利用五氯酚中氯元素的35Cl和37Cl兩種同位素，選定4個同位素母離子對(262.8>262.8，264.8>264.8，266.7>266.7和268.7>268.7)進行定性定量分析，滿足確證要求[23]。其中，定量離子對為262.8>262.8，定性離子對為264.8>264.8，266.7>266.7和268.7>268.7，具體條件見表2。

2.3.2 色譜條件的確定 比較水，5 mmol/L乙酸銨水溶液和5 mmol/L乙酸銨的0.1%甲酸水溶液3種流動相后發現，以水為流動相，五氯酚峰型較差，影響定量準確；以5 mmol/L乙酸銨水溶液為流動相，峰型改善，但保留性較差，易受強極性雜質干擾；以5 mmol/L乙酸銨的0.1%甲酸水溶液為流動相，峰型尖銳，保留增強。因此，最終選用5 mmol/L乙酸銨的0.1%甲酸水溶液為流動相B相，與乙腈(A相)組合進行梯度洗脫，梯度洗脫程序見表3。五氯酚為強極性的酸性化合物，C18色譜柱上保留較差。流動相中加入甲酸，可降低pH值，使五氯酚以分子形態存在，水中溶解性降低，極性減弱，獲得較好保留；同時可降低色譜柱殘余硅羥基的活性，降低五氯酚與硅羥基的次級相互作用，獲得較好色譜峰型。加入乙酸銨，可提高五氯酚的離子化效率，提高靈敏度[3]，改善峰型，具有緩沖作用，能維持流動相pH值穩定。

2.3.3 基質效應與內標選擇

(1)基質效應：液相色譜—質譜分析中，受共流出干擾物和電離競爭抑制的影響，目標物的質譜信號會小于或大于相同濃度的溶劑標準溶液的響應值，存在基質效應。基質效應影響分析的靈敏度、準確度和精密度。稀釋樣品基質、凈化樣品基質、優化色譜分離條件和質譜分析條件、使用內標物、配制基質標準曲線等可減小基質效應[24]。

表2 五氯酚、五氯酚-13C6和五溴酚的質譜條件Table 2 Mass spectrum conditions of pentachlorophenol,pentachlorophenol-13C6 and pentabromophenol

表3 流動相梯度洗脫程序Table 3 Gradient of mobile phase

通過配制豬肉、豬肝、雞肉、雞蛋、魚肉、蝦、蟹、牛奶等樣品的基質標準曲線，與溶劑標準曲線比較，測得豬肉、豬肝、雞肉、雞蛋、魚肉、蝦、蟹和牛奶的基質效應分別為-22.8%，-32.3%，-23.6%，6.0%，10.8%，-34.8%，-25.9%，-7.1%。其中，雞蛋、魚肉、牛奶因含水量較大，基質效應較低，為弱基質效應(|ME|<20%)，其他樣品為中等強度基質效應(20%≤|ME|≤50%)[25]。當同時檢測多種不同類型樣品時，需配制多條基質標準曲線，基質復雜，操作繁瑣。故本研究采用內標法定量，簡化操作。

(2)內標物的選擇：通過比較五氯酚的同位素內標五氯酚-13C6和性質相近的鹵素內標五溴酚，由圖4可知，五氯酚-13C6和五氯酚m/z只相差6，而基于氯元素的同位素選擇母離子對，五氯酚-13C6和五氯酚存在相同母離子對268.7>268.7，質譜信號發生疊加，影響定量定性結果。因此，最終選用五溴酚作為內標。

圖4 五氯酚、五氯酚-13C6和五溴酚的一級質譜圖Figure 4 Mass spectrum of pentachlorophenol,pentachlorophenol-13C6 and pentabromophenol

2.4 方法學評價

五氯酚在0.2～10.0 μg/L范圍內線性關系良好，回歸方程為y=0.600 75x+0.030 01(r=0.999 38)，定量限為1.0 μg/kg。由表4可知，五氯酚的回收率為86.0%～106.0%，相對標準偏差為1.62%～4.27%。由圖5可知，五氯酚和五溴酚的色譜分離效果良好，無雜質峰干擾。此方法靈敏度高，重現性好，準確度和精密度較高。

3 結論

本研究對提取溶劑、固相萃取柱、洗脫液、質譜分析和色譜分離條件、內標物等進行了優化，建立了動物源食品中五氯酚及其鈉鹽測定的全自動固相萃取—超高效液相色譜—串聯質譜法。樣品中加入五溴酚內標，經5%氨水—乙腈提取，運用全自動高通量柱式固相萃取系統，Oasis MAX固相萃取柱凈化，5%氨水溶液、甲醇、甲酸—甲醇—水溶液(2∶49∶49，體積比)淋洗，10%甲酸—甲醇溶液洗脫，氮吹濃縮后用乙腈—水溶液(50∶50，體積比)定容，以乙腈和5 mmol/L乙酸銨的0.1%甲酸水溶液為流動相梯度洗脫，Kinetex C18色譜柱分離，利用氯的同位素選定母離子對并進行質譜分析測定。在不同動物源樣品基質下，該方法分離效果良好，靈敏度高，準確度和精密度較好，能滿足動物源性食品中五氯酚及其鈉鹽殘留的確證分析要求，后續可進一步研究并建立動物源食品中多種氯酚類化合物的測定方法。

表4不同樣品中五氯酚的回收率和相對標準偏差
Table 4Extraction percentage and relative standard deviations of pentachlorophenol in different samples(n=6)

樣品加標量/(μg·kg-1)測定值/(μg·kg-1)回收率/%RSD/%1.00.8787.04.13豬肉5.04.7194.23.4210.09.8298.22.321.01.06106.04.27豬肝5.04.6693.23.9010.09.5695.63.881.00.9494.04.05雞肉5.04.9298.43.1610.09.7297.23.041.00.9292.03.15雞蛋5.05.02100.42.3910.09.6596.52.661.00.9393.03.27魚肉5.04.7294.42.4610.010.09100.91.621.00.8686.02.15蝦 5.04.8296.43.1810.09.6696.63.631.00.8989.03.43蟹 5.04.5791.42.8910.09.2592.53.271.00.9595.02.94牛奶5.04.7294.41.9510.09.6196.12.08

圖5 豬肉加標樣品的MRM質譜圖Figure 5 MRM mass spectrum of pork spiked sample (5 μg/kg)