過氧化氫處理中鼠傷寒沙門氏菌VBNC態形成及其機制解析

聶新穎 廖紅梅 劉元法

(江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

沙門氏菌(Salmonellaspp.)是一種常見的食源性致病菌，屬于革蘭氏陰性腸道桿菌，其血清型具有致病性[1]。該病原菌主要寄居于胃腸道，引起胃腸道感染，其菌型繁多，分布廣泛[2]。在全球食物中毒引發的安全事件中，由沙門氏菌引起中毒的病例常居于首位。據報道[3]，細菌性腹瀉導致全球每年23萬人左右死亡，其中很大一部分是由沙門氏菌感染引起的。鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellaentericaserovar Typhimurium)是近年來報道頻率較高的血清型之一[4]，可通過污染食物造成人類腸道感染或畜禽腹瀉，是重要的人畜共患病原菌；每年因鼠傷寒沙門氏菌引起的感染占沙門氏菌感染總量的20%，造成了嚴重的經濟損失[5]。

活的非可培養(viable but non-culturable,VBNC)狀態是指某些微生物遇到不利環境進入的一種特殊休眠狀態[6]。處于該狀態的微生物在常規培養基上不能形成菌落，但仍保留呼吸、代謝活性、膜完整性和微弱基因轉錄，在合適的條件下又可恢復可培養性[7]。因此，食源性致病菌一旦進入VBNC狀態，可能會漏檢進而造成食品安全事故及至危害人類健康。目前已有文獻報道光[8]、低溫[9]、寡營養[10]、過氧化氫[11]、次氯酸鈉[12]等處理能夠誘導沙門氏菌進入VBNC狀態。

早在18世紀便發現過氧化氫，并在食品、飲料、醫療器械和衛生保健領域廣泛運用。過氧化氫的使用主要依賴其氧化性，不同濃度的過氧化氫具有不同的用途。一般醫用過氧化氫(俗稱雙氧水)使用濃度為3%[13]，工業用過氧化氫濃度一般為25%～50%[14]。與工業級過氧化氫不同，食品級的過氧化氫中沒有蒽醌類有機雜質，以及鉛砷等對人體有害的金屬物質，因而被廣泛應用于果汁、飲料、乳品、飲用水、啤酒、果蔬保鮮以及無菌包裝等食品的生產和消毒[15]。已有文獻[16]報道低濃度過氧化氫會使培養基中腸炎沙門氏菌進入VBNC休眠狀態，造成生物漏檢。然而，至今卻無研究揭示低濃度過氧化氫處理使鼠傷寒沙門氏菌形成VBNC狀態的機制。

本試驗擬研究自來水體系中食品級過氧化氫對鼠傷寒沙門氏菌活性和可培養性的影響，并通過分析掃描電鏡、透射電鏡、相關胞內酶活、自由基產生與鼠傷寒沙門氏菌活性及可培養性的關系以探究其VBNC態的產生機制，旨在為過氧化氫在食品工業中殺菌消毒領域的應用提供理論支持和技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株及培養條件

鼠傷寒沙門氏菌(S.Typhimurium)CMCC 50115：中國醫學細菌菌種保菌管理中心(National Center for Medical Culture Collections，CMCC)。

鼠傷寒沙門氏菌采用BPY(Beef Peptone Yeast)培養基[牛肉膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉5 g/L、酵母粉5 g/L 和葡萄糖5 g/L，pH (7.0±0.2)]培養，培養基經過高壓滅菌后使用[17]。挑取單菌落于100 mL BPY培養基中37 ℃培養10 h 達到對數穩定期(菌落數為1×108～9×108CFU/mL)，停止培養。另外，于BPY培養基中添加1.5%瓊脂粉，以用于平板計數檢測其可培養數。

1.2 主要儀器和試劑

熒光定量PCR儀：ABI 7900 HT型，美國應用生物系統公司；

電子自旋共振波譜儀：EMXplus-10/12型，德國布魯克科技有限公司；

激光共聚焦熒光顯微鏡：LSM710型，德國蔡司公司；

掃描電鏡：Hitachi Model SU8010型，日本JEOL公司；

透射電鏡：JEM-1230型，日本JEOL公司。

DNA提取試劑盒：北京天根生化科技有限公司；

細菌RNA提取試劑：杭州博日公司；

LIVE/DEAD?BacLightTM試劑盒：美國Molecular Probes公司；

DMPO自由基捕獲劑：>97.0%，日本TCI公司；

食品級過氧化氫：30%，上海哈勃化學技術有限公司；

過氧化氫酶檢測試劑盒、總SOD活性檢測試劑盒(WST-8法)、總谷胱甘肽過氧化物酶檢測試劑盒：碧云天生物技術有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 過氧化氫處理 取10 mL培養至對數生長期的鼠傷寒沙門氏菌于90 mL滅菌BPY培養基中，調整菌液濃度為1×107～9×107CFU/mL。混勻后分成10 mL/份稀釋菌液于15 mL離心管中，在4 ℃下5 500 r/min離心10 min，棄上清，用無菌生理鹽水洗菌體兩次，加入等體積的無菌自來水重懸。向其中加入一定體積30 g/100 g食品級過氧化氫溶液，使其終濃度分別為0.2，0.5，1.0，2.0，3.0，5.0，10.0，15.0，1 000，10 000 mmol/L，37 ℃暗反應1.5 h 后4 ℃下5 500 r/min離心10 min，再用無菌自來水重懸，此步驟重復3次以去除體系中的過氧化氫終止反應，處理后的樣品進行下一步試驗。

1.3.2 鼠傷寒沙門氏菌總菌數、活菌數和可培養數定量檢測方法

(1)DNA和RNA的提取：按照試劑盒步驟分別提取細菌DNA和 RNA。用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Takara,Kusatsu,Japan)去除RNA中DNA的干擾，并進行反轉錄。將提取的DNA和反轉錄得到的cDNA于-20 ℃保存備用。DNA作為qPCR的模板，cDNA作為RT-qPCR的模板。

(2)qPCR引物設計和反應條件：以沙門氏菌保守序列invA基因[18]設計特異性引物，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。前引物：5′-ACAGTGCTCGTTTACGACC-3′；后引物：5′-ACTGGTACTGATCGATAAT-3′，擴增片段大小為240 bp。根據Liao等[19]的方法進行熒光定量PCR擴增。試驗結果用ABI 7900 HT軟件進行分析。

(3)總菌數、活菌數、可培養數和VBNC數的檢測：采用相對標準曲線法。將qPCR和RT-qPCR獲得的CT值與對應的細胞數建立線性標準曲線，將待測樣品的CT值代入線性方程分別計算總菌數和活菌數。用平板計數測定可培養數。

參考Jiang等[11]的方法計算鼠傷寒沙門氏菌的VBNC細胞數和VBNC發生系數：

a=b-c，

(1)

式中：

a——VBNC細胞數，CFU/mL；

b——活細胞數，CFU/mL；

c——可培養細胞數，CFU/mL。

(2)

式中：

d——VBNC發生系數。

1.3.3 掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)觀察細胞形態和結構 將對照和過氧化氫(15 mmol/L)處理的樣品在4 ℃ 下5 500 r/min 離心10 min后收集細菌沉淀物。用0.85% 無菌生理鹽水洗滌沉淀，并在4 ℃下5 500 r/min 離心10 min，此過程重復3次。將洗過的樣品用2.5% 戊二醛重懸，4 ℃過夜固定。根據Ding等[20]的方法進行掃描和透射電子顯微鏡分析。

1.3.4 酶活性檢測 將過氧化氫(15 mmol/L)處理后的樣品分為兩份：一份直接測自來水過氧化氫處理液中的酶活，視為胞外酶活；另一份做如下處理以測其胞內酶活：菌液于4 ℃下5 500 r/min離心10 min，棄上清，用無菌生理鹽水清洗兩次，清洗后的細胞重懸并在冰浴條件下超聲(304 W，超聲9 s，停歇30 s，重復5次)，鏡檢以確保細胞完全破碎。將超聲破碎后細菌破碎液于4 ℃，12 000 r/min 離心10 min，取上清液。參照Lin等[21]和Li等[22]的方法檢測鼠傷寒沙門氏菌胞內外過氧化氫酶、總超氧化物歧化酶和總谷胱甘肽過氧化物酶的活性。

1.3.5 自由基強度檢測和圖譜分析 為了定量過氧化氫處理中自來水中產生的自由基，在樣品處理前加入 100 mmol/L DMPO自由基捕獲劑，處理后用電子自旋共振法(Electron Spin Resonance，ESR)檢測并分析自由基。根據Liao等[17]的方法進行自由基強度和圖譜分析。使用Bruker Xenon軟件進行自由基擬合，并以羥基自由基第2條譜線的峰高代表自由基強度以相對定量。

1.3.6 細菌細胞膜完整性分析 LIVE/DEAD?BacLightTM試劑盒包含兩種核酸熒光染料SYTO 9和PI。其中SYTO 9可以透過破損和完整的細胞膜并與DNA結合，在488 nm激發光下呈綠色熒光；而PI只能透過受損的細胞膜并與SYTO 9競爭結合位點，在488 nm激發光下產生紅色熒光。因此在兩種染料都存在的情況下，細胞膜受損的細胞呈紅色熒光，有完整細胞膜的活細胞呈綠色熒光。根據Liao等[19]的方法對過氧化氫處理前后的鼠傷寒沙門氏菌進行染色，然后使用激光共聚焦顯微鏡拍照并分析過氧化氫對于細菌細胞膜完整性和活性的影響。

1.3.7 數據處理及統計分析 每個試驗至少3次重復，2個平行，試驗結果取平均值，并用Microsoft Excel 2013計算標準偏差。采用SPSS Statistics V17.0 軟件(美國SPSS公司)的獨立樣本t檢驗進行顯著性分析(P<0.05)，用Origin 8.5軟件(美國Microcal軟件公司)作圖。

2 結果與討論

2.1 對鼠傷寒沙門氏菌活性和可培養性的影響

過氧化氫處理濃度對鼠傷寒沙門氏菌活性和可培養性的影響如圖1(a)所示。未經過氧化氫處理的鼠傷寒沙門氏菌(對照組，CK)的活菌數和可培養數未顯著性差異(P>0.05)。當過氧化氫濃度在0.2～3.0 mmol/L時，隨著過氧化氫濃度升高，活菌數逐漸減小至4.67 lg CFU/mL；可培養數也逐步且迅速降低，但活菌數和可培養數存在顯著差異(P<0.05)；說明其中部分鼠傷寒沙門氏菌進入了VBNC狀態。當過氧化氫為5.0～15.0 mmol/L時，可培養數降低至平板計數法的檢測限(<0.1 CFU/mL)，而活菌數為4.03～4.16 lg(CFU/mL)；說明該濃度范圍內自來水中鼠傷寒沙門氏菌全部以VBNC存活；當過氧化氫濃度增大至1.0～10.0 mol/L，活菌數和可培養數均在檢測限以下，說明自來水中鼠傷寒沙門氏菌全部被殺滅。如圖1(b)所示，即在較低濃度范圍內(0.2～15.0 mmol/L)隨著過氧化氫濃度的升高，VBNC發生系數增大。

以上研究結果說明低濃度過氧化氫處理可能會導致鼠傷寒沙門氏菌進入VBNC態，且隨過氧化氫濃度增大VBNC態發生系數增大。Morishige等[16]的研究結果顯示10 mmol/L的過氧化氫處理45 min才能使肉湯培養基體系中腸炎沙門氏菌完全喪失可培養性；而Kong等[23]報道2 mmol/L的過氧化氫在室溫下處理45 min對野生型創傷弧菌的可培養性無影響；這可能是菌種、體系和處理時間的不同導致沙門氏菌對過氧化氫的抗性有差異。但當其濃度增大到一定程度時，細菌無法抗衡較高濃度過氧化氫造成的損傷而全部被殺滅。

*** 表示差異顯著(P<0.05);NS 表示無顯著性差異(P>0.05)
圖1 過氧化氫處理對S.Typhimurium總菌數、活菌數、可培養數和VBNC發生系數的影響
Figure 1 Effect on total,viable,culturable numbers and VBNC incidence index ofS.Typhimurium by hydrogen peroxidetreatment

2.2 對鼠傷寒沙門氏菌活性和可培養性的影響機制

2.2.1 對鼠傷寒沙門氏菌細胞形態和結構的影響 如圖2 所示，未處理的細胞表面光滑且飽滿，大部分細胞呈長桿狀[圖2(a)]；而經過氧化氫處理的大部分細胞表面褶皺塌陷甚至破裂，細胞收縮彎曲變小，少數細胞表面光滑且形態接近圓棒狀[圖2(b)]。透射電鏡觀察到未處理的鼠傷寒沙門氏菌細胞質分布均勻，胞內物質完整[圖2(c)]；而經過氧化氫處理的大部分細菌細胞質受到嚴重的損傷，主要表現在胞內物質聚集、外漏甚至變成“空殼”。但仍有極少數細胞質均勻分布，未受任何損傷，結合掃描電鏡觀察的結果可判斷該部分細胞為了應對過氧化氫的脅迫而進入VBNC休眠狀態，已有報道[24]表明VBNC狀態的細胞通常表現出矮化(細胞尺寸減小)現象，細胞形態變為球形，細胞膜完整。

圖2 過氧化氫處理對S.Typhimurium的外部形態(SEM，10 000×)和內部結構(TEM，20 000×)的影響
Figure 2 Effect on the external morphology (SEM,10 000×)and internal structure (TEM,20 000×)ofS.Typhimurium by hydrogen peroxide treatment

如圖3所示，未經處理的鼠傷寒沙門氏菌胞內CAT、SOD、GPx活性較高，經過氧化氫處理進入VBNC狀態的鼠傷寒沙門氏菌胞內CAT活性顯著降低，幾乎為零，與Kong等[23]報道的過氧化氫酶活性喪失使細胞變得不可培養以及Harris等[31]研究表明幽門螺桿菌的過氧化氫酶缺陷型突變體對過氧化氫敏感而野生型可以抵抗100 mmol/L 過氧化氫結果具有一致性。除CAT活性降低外，與細胞抗氧化相關的SOD和GPx活性也顯著降低，表明經過氧化氫處理后細胞抗氧化系統受到嚴重損傷，細胞代謝活性顯著降低。

過氧化氫處理條件：15 mmol/L，37 ℃ 暗反應1.5 h圖3 過氧化氫處理對S.Typhimurium酶活性的影響Figure 3 Effect on the enzyme activities of S.Typhimurium by hydrogen peroxide treatment

2.2.3 過氧化氫處理中產生自由基對鼠傷寒沙門氏菌活性和可培養性的干預 由于過氧化氫的殺菌因子并非其本身，而主要是其分解后產生的自由基和活性衍生物[32]，因此本研究測定了15 mmol/L過氧化氫處理鼠傷寒沙門氏菌90 min 內產生的自由基。在0～30 min內，隨著過氧化氫處理時間的延長，活菌數和可培養數逐漸減小，30 min 時活菌數降至4.16 lg(CFU/mL)，可培養數低于平板計數的檢測限(<0.1 CFU/mL)[圖4(a)]；相應自由基強度和VBNC發生系數隨著過氧化氫處理時間延長而增大，30 min時VBNC發生系數達到最大值[圖4(b)]；產生自由基圖譜的峰高也逐漸增加[圖4(c)]。然而，30～90 min內，無論過氧化氫處理時間持續多久，活菌數基本保持不變，可培養數均在平板計數的檢測限以下，說明殘留活菌全部以VBNC狀態存在。

過氧化氫處理條件：15 mmol/L，37 ℃ 暗反應1.5 h

圖4 過氧化氫處理時間對S.Typhimurium總菌數、活菌數和可培養數、自由基強度和VBNC發生系數以及ESR自由基圖譜的影響
Figure 4 Effect of hydrogen peroxide treatment on total,viable,culturable numbers ofS.Typhimurium,intensity of free radicals and VBNC incidence indexes and ESR spectra of free radicals at different times

隨著過氧化氫處理時間的延長，自由基強度卻有所下降，可能有3種原因：① 過氧化氫在光照下會有少量分解為O2和H2O[33]；② 自由基非常活潑，存在壽命非常短，一經產生就會馬上與接觸物質發生反應，而自由基與DMPO的自旋加合物存在時間也僅僅只有幾分鐘或幾十分鐘[34]；③ 體系中捕捉劑DMPO加入量不夠，已經完全與處理過程中產生的自由基加合。此外，過氧化氫處理時間延長并未引起活菌數、可培養數和VBNC發生指數的變化，表明低濃度過氧化氫誘導細菌進入VBNC狀態在短時間內是不可逆的過程。

2.2.4 自由基參與誘導鼠傷寒沙門氏菌VBNC 狀態形成的驗證 試驗結果表明，加入100 mmol/L的丙酮酸鈉自由基清除劑后鼠傷寒沙門氏菌活菌數和可培養數均增加[圖5(a)]；VBNC發生系數降低[圖5(b)]；過氧化氫處理的自來水體系中除產生高強度的羥基自由基外，還產生了低強度的氫質子自由基和烷基自由基[圖6(a)]，但是由于0.5 mmol/L過氧化氫濃度低，產生的自由基強度不高，因而只能觀察到羥基自由基的存在[圖6(b)]，自由基ESR圖譜表明加入丙酮酸鈉后其峰值降低。進而通過激光共聚焦顯微鏡直接觀察可看到加入丙酮酸鈉后綠色熒光細胞數增多，說明細菌活性被保護(圖7)；而在過氧化氫處理后再加入自由基清除劑對細菌細胞無保護作用；從而進一步驗證了過氧化氫處理中自由基參與鼠傷寒沙門氏菌VBNC 狀態的形成。

圖5 H2O2處理時加(“+”)丙酮酸鈉和不加(“-”)丙酮酸鈉對S.Typhimurium的總菌數、活菌數和可培養數以及VBNC發生系數的影響
Figure 5 Effect on total,viable,culturable numbers and VBNC incidence indexes ofS.Typhimurium by hydrogen peroxide treatment with/without sodium pyruvate

圖6 H2O2處理時加(“+”)丙酮酸鈉和不加(“-”)丙酮酸鈉對ESR自由基譜圖的影響
Figure 6 Effect on ESR spectra of free radicals by hydrogen peroxide treatment with/without sodium pyruvate

圖7 H2O2處理前加丙酮酸鈉和處理后加丙酮酸鈉對S.Typhimurium活性的影響
Figure 7 Effect on the activity ofS.Typhimurium before hydrogen peroxide treatment with/without sodium pyruvate

3 結論

本試驗研究了食品級過氧化氫對自來水中鼠傷寒沙門氏菌活性和可培養性的影響，并從細胞形態和結構、酶活力、自由基產生等幾個方面解析過氧化氫處理中VBNC狀態發生機制。結果表明，不適當過氧化氫處理，例如0.2～15.0 mmol/L過氧化氫處理1.5 h，不僅不能達到完全殺菌的效果，反而使得其中部分鼠傷寒沙門氏菌進入VBNC特殊休眠狀態而存活，進而造成漏檢。當過氧化氫濃度到達1 mol/L 及以上，可實現完全滅菌。過氧化氫處理過程中產生羥基、烷基和氫質子3種自由基，這些自由基的產生是使細菌進入VBNC狀態的重要原因。進入VBNC狀態的細菌細胞中與氧化相關的CAT、SOD和GPx 3種酶酶活顯著降低，初步表明VBNC狀態發生與其氧化損傷可能相關。但自由基如何參與VBNC狀態形成及該狀態的細菌是否復蘇尚不明確，可進一步開展相關研究。