彭邦遠(yuǎn) 丁小娟 趙澤偉 丁筑紅
(1.興義市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,貴州 興義 562400;2.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550025;3.貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽(yáng) 550025)
刺梨(RosaroxburghiiTratt)系薔薇科薔薇屬落葉灌木,富含黃酮[1]、超氧化物歧化酶[2]、甾醇[3]等生物活性物質(zhì),刺梨香氣成分是其品質(zhì)的重要構(gòu)成[4]。研究表明,水果中芳香物質(zhì)主要以游離態(tài)和鍵合態(tài)形式存在[5],其中游離態(tài)揮發(fā)性物質(zhì)主要用來(lái)呈現(xiàn)水果中的香氣,糖苷鍵合態(tài)風(fēng)味前體主要是通過(guò)糖苷利用其糖的端基碳原子將苷元或者相對(duì)應(yīng)的配基相連形成[6],在水果中以非揮發(fā)性形式存在[5]。在果實(shí)成熟期,水解和高溫等條件下,鍵合態(tài)揮發(fā)性物質(zhì)的糖苷鍵斷裂,游離態(tài)香氣化合物被釋放進(jìn)而被感知[7-9]。刺梨汁主要是利用β-葡萄糖苷酶或相應(yīng)的酸解處理,進(jìn)而可以得到刺梨風(fēng)味前體中獨(dú)有的鍵合態(tài)物質(zhì),進(jìn)而可強(qiáng)化和增強(qiáng)刺梨相關(guān)產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì),該方法已成為水果制品增香的重要途徑。目前,研究者[10-12]已從刺梨中分離鑒定出130余種揮發(fā)性成分,主要以醇類(lèi)、酯類(lèi)和酸類(lèi)物質(zhì)為主。而對(duì)刺梨汁中揮發(fā)性物質(zhì)和香氣成分的來(lái)源及構(gòu)成缺乏系統(tǒng)分析,特別是鍵合態(tài)香氣成分信息不夠清楚。相關(guān)研究表明,鍵合態(tài)風(fēng)味物質(zhì)的釋放方法中,酶法條件較為溫和且不會(huì)導(dǎo)致物質(zhì)結(jié)構(gòu)變化[13],所釋放的香氣更能夠呈現(xiàn)水果的特征香氣[14]。本研究利用AmberliteXAD-2樹(shù)脂分離鍵合態(tài)香氣物質(zhì),通過(guò)探究β-葡萄糖苷酶與酸解刺梨汁鍵合態(tài)風(fēng)味前體的揮發(fā)性物質(zhì)的組成差異,以及刺梨汁中糖苷鍵合態(tài)香氣化合物的糖基組成,以期為刺梨汁及其加工制品的增香調(diào)控提供理論依據(jù)。
刺梨:采摘新鮮且充分成熟的貴農(nóng)5號(hào)品種,產(chǎn)于貴州龍里刺梨種植基地。
C7~C30正構(gòu)烷烴混合標(biāo)樣:色譜純,美國(guó)Supelco公司;
Almondsβ-D-葡萄糖苷酶(微生物來(lái)源):100 U/g,美國(guó)Sigma公司;
鼠李糖、甘露糖、葡萄糖:生化試劑,中國(guó)Solarbio公司;
硅藻土:化學(xué)純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司;
正戊烷、乙醚、乙酸乙酯、甲醇、氯仿等:分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司。
GC/MS聯(lián)用儀:HP6890/5975C型,美國(guó)安捷倫公司;
彈性石英毛細(xì)管柱:ZB-5MSI 5%Phenyl-95%DiMethylpolysiloxane (30 m×0.25 mm×0.25 μm),美國(guó)安捷倫公司;
硅橡膠隔墊:PTFE型,美國(guó)安捷倫公司;
手動(dòng)固相微萃取裝置:2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS型 StableFlex纖維頭,美國(guó)Supelco公司。
1.3.1 刺梨汁的制備 刺梨果實(shí)經(jīng)挑選、清洗、去蒂、切分、榨汁,4層紗布粗濾,在4 ℃,12 000 r/min冷凍離心15 min,留上清液備用。
1.3.2 Amberlite XAD-2樹(shù)脂柱處理 參照文獻(xiàn)[15]。
1.3.3 刺梨汁鍵合態(tài)香氣前體物的提取 將刺梨汁(3 mL/min)上柱靜置吸附10 h,用400 mL去離子水(3 mL/min)洗脫除去水溶性糖、酸等成分;用300 mL乙醚—戊烷(體積比1∶1)(3 mL/min)洗脫游離態(tài)組分;用300 mL甲醇(3 mL/min)洗脫鍵合態(tài)組分,得洗脫液。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在35 ℃將甲醇洗脫液濃縮至干,溶解于pH 5.0,20 mL 0.06 mol/L檸檬酸緩沖液,分3次用120 mL 乙醚—戊烷(體積比1∶1)萃取去除游離態(tài)組分,水相備用[16-18]。
1.3.4 刺梨汁鍵合態(tài)香氣前體物的酶解 參照文獻(xiàn)[19]。
1.3.5 刺梨汁鍵合態(tài)香氣前體物的酸解 將刺梨汁水相中的萃取物用1.0 mol/L HCl調(diào)整pH為1.0,沸水浴60 min,在將溶液用1.0 mol/L NaOH調(diào)節(jié)至中性,分3次用120 mL乙醚—戊烷(1∶1)萃取酸解液,除去鍵合態(tài)揮發(fā)性物質(zhì),水相于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干,備用[6,20]。
1.3.6 刺梨汁水解后香氣物質(zhì)分析 將1.3.4、1.3.5中乙醚—戊烷(體積比1∶1)萃取液,分別用Na2SO4干燥(4 ℃靜置4 h)除水,過(guò)濾,濃縮至5 mL,用N2吹至0.5 mL,取20 μL濃縮液,用二氯甲烷定容至1 mL,取1 μL 進(jìn)樣,供GC-MS分析。
采用“氣味活化值(odor activity value,OAV)”[21-23]明確刺梨汁中主要揮發(fā)性物質(zhì)。氣味活化值指氣味的物質(zhì)濃度與其閾值的比值,反映各香氣組分對(duì)刺梨汁整體香氣的貢獻(xiàn)情況,按式(1)計(jì)算:
(1)
式中:
OAV——?dú)馕痘罨担?/p>
C——化合物在果汁中的絕對(duì)濃度;
T——化合物在果汁中的感覺(jué)閾值。
OAV值越大,對(duì)香氣的貢獻(xiàn)越大。當(dāng)OAV>1時(shí),為果汁中典型揮發(fā)性物質(zhì)(OAV>10時(shí),為果汁中重要揮發(fā)性物質(zhì));當(dāng)OAV<1時(shí),該化合物對(duì)果汁整體香氣無(wú)明顯作用。由于本研究樣品包含較多揮發(fā)性物質(zhì),精確定量非常繁瑣且成本較高,且試驗(yàn)旨在篩出OAV最高的揮發(fā)性物質(zhì)。因此,可用所測(cè)揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)百分含量分析。W按式(2)計(jì)算:
W=f×C×100%,
(2)
式中:
W——所測(cè)揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)百分含量,%;
f——相對(duì)質(zhì)量矯正因子;
C——化合物在果汁中的絕對(duì)濃度。
相對(duì)氣味活度值(relative odor activity value,ROAV)[21],樣品中對(duì)總體風(fēng)味貢獻(xiàn)最高的組分ROAV值為100,其他組分(A)則有:
(3)
式中:
ROAVA——A組分的相對(duì)氣味活化值;
OAVA——A組分的氣味活化值;
OAVmax——A組分對(duì)總體風(fēng)味貢獻(xiàn)最高值。
由式(1)~(3)可得:
(4)
式中:
Wmax——對(duì)刺梨總體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的組分的相對(duì)百分含量,%;
WA——各揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)百分含量,%;
TA——各揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)感覺(jué)閾值;
Tmax——各揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)刺梨總體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的相應(yīng)的感覺(jué)閾值。
ROAV≥1表示揮發(fā)性物質(zhì)為刺梨關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì),0.1≤ROAV≤1表示揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)刺梨總體風(fēng)味存在重要修飾作用[24]。
1.3.7 樣品衍生物的制備 參照文獻(xiàn)[25]59-60。
1.3.8 糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生物的制備 參照文獻(xiàn)[26]87。
1.3.9 刺梨汁揮發(fā)性香氣成分及GC-MS條件
(1)GC條件:色譜柱為ZB-5MSi 5% Phenyl-95% DiMethylpolysiloxane (30 m×0.25 mm×0.25 μm)石英毛細(xì)管柱,柱溫45 ℃(保留2 min),4 ℃/min升溫至220 ℃ (保留2 min);汽化室溫度250 ℃;載氣為高純氦氣(99.999%);柱前壓52 538.071 2 Pa,載氣流量1.0 mL/min;不分流進(jìn)樣;溶劑延遲時(shí)間:1.5 min。
(2)MS條件:EI源為離子源,溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;電子能量70 eV;發(fā)射電流34.6 μA;倍增器電壓1 615 V;接口溫度280 ℃;質(zhì)量范圍20~450 amu。糖衍生物樣品色譜條件:色譜柱為HP-5MS(5% Phenyl-95% DiMethylpolysiloxane)(30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細(xì)管柱,F(xiàn)ID檢測(cè)器溫度250 ℃,氣化室溫度280 ℃,進(jìn)樣量1 μL。程序升溫,起始溫度160 ℃,10 ℃/min 升至180 ℃,3 ℃/min升溫至208 ℃(保留2 min),1 ℃/min升溫至210 ℃(保留4 min)。
1.3.10 酶解酸解刺梨汁鍵合態(tài)化合物的定性定量分析
運(yùn)用計(jì)算機(jī)譜庫(kù)(Nist/Wiley)將檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行初期檢索,參照相關(guān)文獻(xiàn)資料定性,確定其分子式。其相對(duì)含量采用峰面積歸一法確定[27]。
1.3.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果用Excel 2010軟件統(tǒng)計(jì),HPLC及GC-MS結(jié)果由SPSS 20.0進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析。
由圖1~2和表1可知,刺梨汁鍵合態(tài)底物經(jīng)酶解、酸解共檢出49種揮發(fā)性物質(zhì),β-葡萄糖苷酶水解得到31種揮發(fā)性物質(zhì),酸類(lèi)10種(25.78%)、醛類(lèi)3種(19.96%)、醇類(lèi)7種(16.79%)、酮類(lèi)4種(13.38%)、酯類(lèi)3種(11.03%)、酚類(lèi)1種(7.14%)、烯烴類(lèi)2種(3.46%)、呋喃1種(0.16%),含量較高的物質(zhì)有乙醛(9.78%)、硬脂酸(9.68%)、4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)呋喃酮(8.78%)、乙酸乙酯(8.37%)、愈創(chuàng)木酚(7.14%)等。酸解釋放24種揮發(fā)性物質(zhì),呋喃1種(0.57%)、酸類(lèi)3種(0.83%)、醇類(lèi)2種(1.14%)、酯類(lèi)2種(1.25%)、烯烴類(lèi)7種(3.36%)、酮類(lèi)2種(18.59%)、酚類(lèi)7種(53.23%),含量較高的物質(zhì)有2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(49.55%)、胡薄荷酮(13.71%)、5-己烯-2-酮(4.88%)、5-甲基間苯二酚(2.03%)、α-無(wú)水葡萄糖酯(1.10%)。酸解和酶解對(duì)釋放刺梨汁鍵合態(tài)風(fēng)味前體物質(zhì)有較大差異,共同的風(fēng)味物質(zhì)分別為肉桂酸、棕櫚酸、油酸、胡薄荷酮、2,3-二氫-2-甲氧苯并呋喃。風(fēng)味前體水解物的不同主要與糖苷類(lèi)前體的斷鍵方式存在相關(guān)性,酶解反應(yīng)主要斷糖苷鍵,而酸解反應(yīng)斷醚鍵[28]。酸解反應(yīng)在高溫條件下斷鍵更徹底,酶解依賴(lài)于酶的種類(lèi)及活性。酶解主要釋放酸類(lèi)、醛類(lèi)、醇類(lèi)物質(zhì),醇、醛類(lèi)物質(zhì)呈青草味,酸解主要釋放烯烴類(lèi)、酮類(lèi)及酚類(lèi)物質(zhì),酮、酚類(lèi)物質(zhì)呈果香味,烯烴類(lèi)物質(zhì)有花香味[26]5-7。酶解釋放的香氣物質(zhì)更接近刺梨自身香氣,起增香作用[26]93。酸解反應(yīng)條件影響香氣穩(wěn)定性,且酸解無(wú)選擇性,易產(chǎn)生刺激性甚至異味成分[29]。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)酸水解,在刺梨汁中得到風(fēng)味前體有二氫月桂烯醇、芐醇、4-甲基辛烷、5-己烯-2-酮、胡薄荷酮、1,3,5,5-四甲基-1,3-環(huán)己二烯、十六烷、二十二烷、二十五烷等。經(jīng)酶解得到風(fēng)味前體有丙酮醇、3-羥基丁醛、羥基香茅醛、丁酸、己酸等。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)水解后得到風(fēng)味前體有葉醇、蘑菇醇、D-異薄荷醇、肉桂酸、對(duì)羥基肉桂酸、棕櫚酸、2-更酮、乙酸乙酯、愈創(chuàng)木酚,本研究和周志[11]、彭邦遠(yuǎn)等[12]的研究結(jié)果一致。

圖1 刺梨汁鍵合態(tài)揮發(fā)性物質(zhì)的酶解產(chǎn)物GC-MS總離子流圖Figure 1 GC-MS total iol current chromatogram of the bond flavor components enzymolysis products in Rosa roxburghii juice

圖2 刺梨汁鍵合態(tài)揮發(fā)性物質(zhì)的酸解產(chǎn)物GC-MS總離子流圖Figure 2 GC-MS total iol current chromatogram of the bond flavor components acidolysis products in Rosa roxburghii juice
表1酶解與酸解法刺梨汁鍵合態(tài)揮發(fā)性物質(zhì)比較
Table 1The Comparison of Enzymatic Hydrolysis and Acidolysis of bond flavor components inRosaroxburghiijuice

物質(zhì)種類(lèi)化合物相對(duì)含量/%酶解酸解物質(zhì)種類(lèi)化合物相對(duì)含量/%酶解酸解醇類(lèi)乙醇4.64-二氫月桂烯醇-0.39丙酮醇0.16-芐醇0.500.75葉醇4.58-β-桉葉醇4.04-蘑菇醇1.71-D-異薄荷醇1.16-醛類(lèi)乙醛9.78-3-羥基丁醛5.53-羥基香茅醛4.65-酸類(lèi)丁酸0.18-己酸6.73-3-羥基丁酸0.45-苯乙酸2.14-肉桂酸1.500.22對(duì)羥基肉桂酸1.35-棕櫚酸2.100.47油酸0.250.14硬脂酸9.68-3,4-二甲基肉桂酸1.40-酮類(lèi)4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)呋喃酮8.78-5-己烯-2-酮-4.88胡薄荷酮2.4613.712-庚酮0.34-烯烴類(lèi)1,3,5,5-四甲基-1,3-環(huán)己二烯-0.98反式-β-羅勒烯3.35-烷烴類(lèi)十四烷0.11-十七基環(huán)己烷-0.114-甲基辛烷-0.39十六烷-0.73二十一烷-0.31二十二烷-0.39二十五烷-0.46酯類(lèi)檸檬酸三乙酯2.41-乙酸乙酯8.37-α-無(wú)水葡萄糖酯-1.10苯二甲酸丁酯0.25-棕櫚酸乙酯-0.15酚類(lèi)苯酚-0.204-丙基苯酚-0.062,6-二叔丁基對(duì)甲酚-49.554-烯丙基-2,6-二甲氧基苯酚-0.825-甲基間苯二酚-2.032,4-二氨基苯酚-0.28愈創(chuàng)木酚7.14-4-甲基-6-叔丁基苯酚-0.28其他樟腦1.75-2,3-二氫-2-甲氧苯并呋喃0.160.57
由表2可知,酸類(lèi)、酚類(lèi)物質(zhì)閾值較高,飽和烷烴為揮發(fā)性非嗅感物質(zhì),不易引起嗅感[29]對(duì)特征風(fēng)味貢獻(xiàn)較小。經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解得到β-桉葉醇(ROAV=1.84)、3-羥基丁醛(ROAV=2.52)及愈創(chuàng)木酚(ROAV=1.84)3種物質(zhì)ROAV>1,可能為酶解刺梨汁鍵合態(tài)風(fēng)味物質(zhì)的重要香氣成分。乙醛(ROAV=0.30)對(duì)酶解液整體風(fēng)味具有重要的修飾作用。酸解法主要釋放的物質(zhì)為酸類(lèi)和酯類(lèi),棕櫚酸閾值為10 000 μg/kg,棕櫚酸乙酯閾值為2 000 μg/kg,苯酚、4-丙基苯酚閾值分別為5 900,55 μg/kg,均為非嗅感物質(zhì)對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)較小。4-丙基苯酚ROAV<0.1,對(duì)刺梨汁整體香氣貢獻(xiàn)較小。綜上可知,酶解法釋放揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)多于酸解法,酶解后對(duì)刺梨汁風(fēng)味影響較大的風(fēng)味物質(zhì)(ROAV≥1)有4種,其貢獻(xiàn)順序?yàn)椋?-羥基丁醛>β-桉葉醇>愈創(chuàng)木酚>羥基香茅醛;酸解法釋放的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)不明顯。
酶具有專(zhuān)一性和高效性,能夠催化葡萄糖的半縮醛羥基和其它物質(zhì)羥基相連的糖苷鍵[30],通過(guò)移除香味前體的相應(yīng)糖配體釋放揮發(fā)性物質(zhì),而酸解法使糖苷鍵的成鍵原子質(zhì)子化形成陽(yáng)離子中間體,減少空間張力致糖苷鍵斷裂釋放配基[31],使其更易于被酸水解。酸解反應(yīng)較劇烈,釋放風(fēng)味成分不足,刺激性氣味較重[25]47。
? “ND”表示酶解未檢測(cè)到而酸解檢測(cè)到的化合物或酸解未檢測(cè)到而酶解檢測(cè)到的化合物。
利用三氟乙酰化法,對(duì)鍵合態(tài)糖苷糖基進(jìn)行探究,能夠較明確地得到糖苷和糖基的結(jié)構(gòu)[29]。由圖3~6可知,在相同GC-MS條件下混合糖標(biāo)品中鼠李糖、甘露糖、葡萄糖保留時(shí)間為12.674,7.301,12.945 min,與單糖相比在相同檢測(cè)條件下,各保留時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)差均小于±0.038,因此,峰的保留時(shí)間可用于刺梨汁糖基的鑒定。由圖7~8可知,酶解法可釋放的刺梨汁鍵合態(tài)香氣組分含有兩種糖基,保留時(shí)間分別為12.767,13.094 min,與鼠李糖(12.674 min)、葡萄糖(13.097 min)保留時(shí)間相符合,根據(jù)保留時(shí)間定性進(jìn)行GC-MS分析及參考相關(guān)文獻(xiàn),可初步確認(rèn)酶解法能夠得到刺梨汁鍵合態(tài)風(fēng)味物質(zhì)中糖基由葡萄糖、鼠李糖組成。酸解法可釋放的刺梨汁鍵合態(tài)風(fēng)味物質(zhì)的糖基有3種,保留時(shí)間分別為12.784,13.107,7.482 min,與鼠李糖(12.674 min)、葡萄糖(13.097 min)、甘露糖(7.346 min)保留時(shí)間相符合。初步判定,刺梨汁中鍵合態(tài)香氣物質(zhì)的糖基由葡萄糖、鼠李糖、甘露糖組成。酶解與酸解刺梨鍵合態(tài)風(fēng)味前體糖基有差異,共同可釋放的糖基為葡萄糖與鼠李糖。宛曉春等[32]采用HPLC檢測(cè)到酸解后檸檬汁中糖苷鍵合態(tài)揮發(fā)性物質(zhì)的糖基部分可能由葡萄糖和鼠李糖組成。奕志英等[19]采用HPLC檢測(cè)到酶解后石榴汁中糖苷鍵合態(tài)香氣前體物質(zhì)的糖基主要以葡萄糖和果糖為主。目前鑒定出糖苷的糖基部分一般含有葡萄糖、鼠李糖、甘露糖等單糖[33-34],大多數(shù)鍵合態(tài)風(fēng)味物質(zhì)與葡萄糖鍵合[35]。

圖3 鼠李糖的離子流圖Figure 3 GC-MS chromatogram analysis of Rhamnose

圖4 葡萄糖的離子流圖Figure 4 GC-MS chromatogram analysis of Glucose

圖5 甘露糖的離子流圖Figure 5 GC-MS chromatogram analysis of Mannose

圖6 葡萄糖、甘露糖、鼠李糖等混合標(biāo)品的離子流圖Figure 6 GC-MS chromatogram analysis of Galactose,Xylose,Glucose,Mannose,Fructose,Rhamnose

圖7 刺梨汁酶解糖基衍生化離子流圖Figure 7 GC-MS chromatogram of Rosa roxburghii juice enzymatic Glycosylation

圖8 刺梨汁酸解糖基衍生化離子流圖Figure 8 GC-MS chromatogram of Rosa roxburghii juice acidolysis Glycosylation
采用β-葡萄糖苷酶水解刺梨汁鍵合態(tài)香氣前體物質(zhì),共得到49種揮發(fā)性物質(zhì),酶解釋放31種揮發(fā)性物質(zhì),其中乙醛(9.78%)、硬脂酸(9.68%)、4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)呋喃酮(8.78%)、乙酸乙酯(8.37%)、愈創(chuàng)木酚(7.14%)等含量較高。酸水解得到24種揮發(fā)性物質(zhì),其中2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(49.55%)、胡薄荷酮(13.71%)、5-己烯-2-酮(4.88%)、5-甲基間苯二酚(2.03%)、α-無(wú)水葡萄糖酯(1.10%)含量較高。酸解與酶解釋放的香氣物質(zhì)不同,可能與反應(yīng)強(qiáng)度和水解機(jī)制有關(guān)。
經(jīng)ROAV值分析,刺梨汁酶解液中典型揮發(fā)性物質(zhì)多于酸解液,酶解后對(duì)風(fēng)味影響較大的典型風(fēng)味物質(zhì)(ROAV≥1)有4種,貢獻(xiàn)順序?yàn)?-羥基丁醛>β-桉葉醇>愈創(chuàng)木酚>羥基香茅醛;酸解后對(duì)風(fēng)味影響的重要風(fēng)味物質(zhì)少,可能與酸解條件及反應(yīng)劇烈程度有關(guān)。通過(guò)衍生化法探究刺梨汁鍵合態(tài)香氣前體酶解與酸解法可釋放的糖基,得出不同水解法可釋放的糖基不同,本研究初步確定刺梨汁鍵合態(tài)香氣前體物質(zhì)的糖基有葡萄糖、鼠李糖和甘露糖。