FSHβ在BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的作用研究

成亞琳 曾繼濤 黃敏 劉俊銀 涂小林 劉宏*

1．重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖健康與不孕癥中心，重慶400016

2．成都市第五人民醫(yī)院，四川成都611130

3．重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院骨發(fā)育與再生實(shí)驗(yàn)室，重慶400016

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是來源于脂肪組織、骨髓、骨外膜、肌肉等［1-2］的，具有成骨、成軟骨、成脂、成肌等多系分化潛能的有自我更新能力的干細(xì)胞［3-5］，是再生醫(yī)學(xué)骨組織修復(fù)的重要研究目標(biāo)［6］。C3H10T1/2細(xì)胞是從C3H小鼠分離建立的間充質(zhì)干細(xì)胞株，是組織工程骨常用材料之一，研究不同信號(hào)通路在間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的相互作用是組織工程骨研究的重要途徑。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor，TGF-β)超基因家族的重要成員之一，大量研究均證明它在出生后骨形成、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中扮演著重要角色。自19世紀(jì)60年代由Urist發(fā)現(xiàn)并命名［7-8］至今，已鑒定并克隆出20多種成員，其中BMP2、4、7已被臨床用于骨折、骨不連等的輔助治療。BMP9又稱為生長(zhǎng)分化因子2或GDF2［9］，最先在胎鼠肝臟中分離得到［10］，其前體與BMP2、4、5、6、7 有 50%～55%的相同氨基酸序列［11］，以自分泌和旁分泌形式分泌［12］，其在維持血管壁的完整性［13］、抑制心肌纖維化［14］、抑制肝纖維化［15］、誘導(dǎo)成骨分化［16］等方面具有重要作用。BMP9作為最具潛力的誘導(dǎo)成骨分化的骨形態(tài)發(fā)生蛋白之一［17］，部分BMP包括BMP4和BMP7已在臨床中廣泛用于骨缺損、骨再生及脊柱融合術(shù)［18-19］。

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是常見的原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥，特征是骨量減少和骨微結(jié)構(gòu)破壞，骨脆性增加并易于骨折。以前的研究認(rèn)為，PMOP主要原因是雌激素水平的降低，且雌激素用于其治療可降低骨量丟失。但近10年的研究發(fā)現(xiàn)［20］，在圍絕經(jīng)期，雌激素水平尚維持在正常范圍，卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)已顯著升高，且此期骨量丟失較絕經(jīng)后骨量丟失更高，提示FSH與PMOP有強(qiáng)烈相關(guān)性。FSH是來源于垂體前葉的促性腺激素，包括α和β兩個(gè)亞基，其中β亞基是發(fā)揮其特異性功能的主要組成部分［21］，調(diào)節(jié)卵泡生長(zhǎng)和成熟［22］，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)其除與生殖功能相關(guān)外，還與絕經(jīng)后內(nèi)臟性肥胖［23］、骨的重塑密切相關(guān)。部分學(xué)者認(rèn)為［24］，F(xiàn)SH-β主要通過增強(qiáng)骨的吸收來促進(jìn)PMOP的發(fā)生;而Allan等［25］則發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH-β 轉(zhuǎn)基因雌性小鼠能促進(jìn)骨的形成。因此，F(xiàn)SH對(duì)骨的重塑功能和機(jī)制尚存爭(zhēng)議。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHβ在BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中起到促進(jìn)作用，但具體機(jī)制并不明確。

Notch是至關(guān)重要的生長(zhǎng)發(fā)育信號(hào)。當(dāng)鄰近細(xì)胞的受體與配體結(jié)合激活Notch信號(hào)后，Notch受體在 腫 瘤 壞 死 因 子 α 轉(zhuǎn) 化 酶 (TNF-α convertingenzyme，TACE) 和 γ-促 分 泌 酶 (γsecretase)/早老素(presenilin，PS)兩次裂解下，生成胞內(nèi)域(intracellular notch，ICN)進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控靶基因(Hes1/5/7、Hey1/2/L)轉(zhuǎn)錄。有研究認(rèn)為，內(nèi)皮來源的Notch能調(diào)控骨內(nèi)血管和骨的生成［26］;也有研究認(rèn)為，Notch信號(hào)能通過抑制間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化來維持骨髓中的干細(xì)胞數(shù)量［27］，表明Notch信號(hào)在骨中的作用錯(cuò)綜復(fù)雜。此外，許多研究證實(shí)［28-29］，γ-促分泌酶的抑制劑 DAPT 是 Notch信號(hào)的特異性抑制劑，通過阻斷Notch信號(hào)，調(diào)節(jié)其在骨生長(zhǎng)發(fā)育中的作用。有相關(guān)報(bào)道發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)也在BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中扮演著重要作用［11］，但對(duì)FSHβ增強(qiáng)BMP9促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的影響未見報(bào)道。

因此，本研究旨在探討Notch信號(hào)在FSHβ增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的具體作用，進(jìn)一步拓寬FSHβ在骨骼方面的研究，為骨折、骨不連、骨質(zhì)疏松癥等骨骼疾病的防治提供依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 試劑與細(xì)胞培養(yǎng)

C3H10T1/2細(xì)胞和人胚胎腎上皮細(xì)胞-293T均購買于 American Type Culture Collection(ATCC)。細(xì)胞在 DMEM培養(yǎng)基:高糖(90%)、胎牛血清(10%)、鏈霉素(100 mg/L)和青霉素(100 kU/L)中培養(yǎng)，并置于37℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)中使用的堿性磷酸酶染色試劑盒購買于碧云天生物科技有限公司;茜素紅S染料購買于塞米克生物科技有限公司;所用反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購買于寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司;TRIzol購買于賽默飛世爾科技有限公司;DAPT購買于Sigma-Aldrich公司。

1.2 目標(biāo)重組腺病毒(GFP、BMP9、FSHβ)構(gòu)建

采用AdEasy系統(tǒng)［30］構(gòu)建本研究中需要用到的重組腺病毒Ad-GFP、Ad-BMP9和Ad-FSHβ，所有上述3種重組腺病毒均表達(dá)綠色熒光蛋白，其中Ad-GFP用作對(duì)照組。利用293T細(xì)胞擴(kuò)增腺病毒。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與重組腺病毒滴度、藥物濃度測(cè)定

根據(jù)研究目的將實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(Ad-GFP)和實(shí)驗(yàn)組(Ad-FSHβ、Ad-BMP9和 Ad-BMP9+Ad-FSHβ)。在實(shí)驗(yàn)前，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期C3H10T1/2細(xì)胞以適當(dāng)密度(約5×105/孔)接種于24孔板，貼壁后，按不同倍數(shù)稀釋重組腺病毒，以如下體積:0.1、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0、20.0 μL/孔感染細(xì)胞，24 h后觀察綠色熒光，選定重組腺病毒感染率所需稀釋倍數(shù)，并根據(jù)研究目的選擇最佳感染率。最后根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將不同濃度的DAPT加入聯(lián)合感染腺病毒組，根據(jù)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色結(jié)果確定藥物的最佳使用濃度。

1.4 ALP表達(dá)檢測(cè)

將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)C3H10T1/2細(xì)胞以適當(dāng)密度(約5×105/孔)接種于24孔板，細(xì)胞貼壁后，加入對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組選定滴度的重組腺病毒或者藥物，并于第5天按照試劑盒的使用說明對(duì)細(xì)胞進(jìn)行ALP染色。各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 茜素紅S染色測(cè)定鈣鹽結(jié)節(jié)

將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)C3H10T1/2細(xì)胞以適當(dāng)密度(約5×105/孔)接種于24孔板，細(xì)胞貼壁后，按研究目標(biāo)分別加入實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的重組腺病毒感染細(xì)胞，并于病毒感染細(xì)胞后第3天將普通培養(yǎng)基更換為工作濃度為 10 mmol/L β-磷酸甘油鈉、50 μg/mL維生素C的選擇培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至21 d后按照說明書進(jìn)行茜素紅S染色。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)

將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)C3H10T1/2細(xì)胞以適當(dāng)密度(約5×105/孔)接種于24孔板，細(xì)胞貼壁后，按研究目標(biāo)分別加入相應(yīng)的處理因素，于指定時(shí)間點(diǎn)(腺病毒感染后第5天)采用TRIzol法從各組細(xì)胞中提取總RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，最后采用Q-PCR技術(shù)測(cè)定相應(yīng)目的基因mRNA的表達(dá)水平。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。各目的基因引物序列見表1。

表1 Q-PCR引物序列Table 1 Primer sequences table of Q-PCR

1.7 數(shù)據(jù)分析

本研究使用SPSS 22.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)表示;組間比較通過Studen t-test進(jìn)行，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 C3H10T1/2細(xì)胞感染重組腺病毒后相應(yīng)腺病毒mRNA的表達(dá)檢測(cè)和ALP檢測(cè)

C3H10T1/2細(xì)胞在各組腺病毒(Ad-GFP、Ad-FSHβ及Ad-BMP9)感染48 h后提取總RNA并檢測(cè)FSHβ和BMP9 mRNA的表達(dá)水平。利用Q-PCR方法檢測(cè)后，分析其mRNA表達(dá)水平的相對(duì)定量值;于腺病毒處理5 d后利用ALP染色方法觀察細(xì)胞中ALP的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，BMP9處理組較GFP對(duì)照組BMP9 mRNA表達(dá)水平顯著增高，F(xiàn)SHβ處理組較GFP對(duì)照組FSHβ mRNA表達(dá)水平顯著增高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，圖1A、1B);此外，ALP染色顯示，BMP9處理組 ALP染色較GFP對(duì)照組深(圖1C);而FSHβ處理組ALP染色較GFP對(duì)照組無顯著改變(圖中未顯示)。提示各腺病毒成功感染C3H10T1/2細(xì)胞并表達(dá)，且BMP9能誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，而單獨(dú)的FSHβ則無誘導(dǎo)其成骨功能。

2.2 FSHβ增加 BMP9誘導(dǎo) C3H10T1/2細(xì)胞的ALP表達(dá)

骨中ALP活性與骨的鈣化作用密切相關(guān)，是評(píng)價(jià)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的早期指標(biāo)。本研究利用各組重組腺病毒(Ad-GFP、Ad-FSHβ及Ad-BMP9)感染C3H10T1/2細(xì)胞5 d后的ALP表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，F(xiàn)SHβ處理組較GFP對(duì)照組ALP染色無顯著區(qū)別，提示FSHβ對(duì)誘導(dǎo)ALP的表達(dá)無顯著影響;而BMP9處理組較對(duì)照組 ALP染色深，提示BMP9能顯著誘導(dǎo) ALP的表達(dá)。此外，BMP9與FSHβ聯(lián)合處理組較BMP9處理組ALP染色進(jìn)一步加深(圖2)，提示FSHβ能增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)的ALP的表達(dá)。

圖1 GFP、BMP9和FSHβ重組腺病毒分別感染C3H10T1/2細(xì)胞后48 h相應(yīng)mRNA表達(dá)水平及5 d后ALP表達(dá)檢測(cè)(100×) A:Q-PCR結(jié)果顯示BMP9重組腺病毒感染C3H10T1/2細(xì)胞48 h后BMP9 mRNA表達(dá)水平(n=3，t-test，＊＊P=0.0006 vs GFP組);B:Q-PCR結(jié)果顯示FSHβ重組腺病毒感染C3H10T1/2細(xì)胞48 h后FSHβ mRNA表達(dá)水平(n=3，t-test，＊＊P=0.0004 vs GFP組);C:ALP染色結(jié)果顯示BMP9重組腺病毒感染C3H10T1/2細(xì)胞5 d后ALP表達(dá)(100×)Fig．1 Corresponding mRNA expression levels of GFP，BMP9 and FSHβ recombinant adenoviruses treated C3H10T1/2 cells at 48 h and ALP expression at 5 d(100×)．A:Q-PCR analysis of BMP9 mRNA levels in C3H10T1/2 cells treated with BMP9 recombinant adenovirus for 48 h(n=3，t-test，＊＊P=0.0006 vs GFP group);B:Q-PCR analysis of FSHβ mRNA levels in C3H10T1/2 cells treated with FSHβ recombinant adenovirus for 48 h(n=3，t-test，＊＊P=0.0004 vs GFP group);C:The ALP staining of C3H10T1/2 cells treated with BMP9 recombinant adenovirus for 5 d(100 ×)．

圖2 光學(xué)顯微鏡下各組ALP染色情況(100×)Fig．2 The ALP staining in each group by the light microscope(100×)

2.3 FSHβ增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞成骨中鈣鹽的沉積

在間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞期間，隨著細(xì)胞繼續(xù)分化，骨基質(zhì)礦化不斷增多，與之相關(guān)的鈣鹽沉積也會(huì)增加，因而鈣鹽結(jié)節(jié)成為成骨分化的晚期標(biāo)志物?；诒狙芯吭缙诔晒欠只瘶?biāo)志物的表達(dá)情況，進(jìn)一步檢測(cè)相同處理下各組鈣鹽沉積情況。結(jié)果顯示，GFP和FSHβ處理組無明顯的鈣鹽結(jié)節(jié)形成，而BMP9處理組有明顯的鈣鹽結(jié)節(jié)形成，證實(shí)BMP9確有促進(jìn)成骨的功能;而BMP9與FSHβ聯(lián)合處理組，鈣鹽結(jié)節(jié)的形成量較BMP9處理組顯著增加(圖3)。綜上，提示FSHβ增加BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中鈣鹽的沉積。

圖3 光學(xué)顯微鏡下FSHβ對(duì)BMP9誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞的鈣鹽沉積影響(100×)Fig．3 Effect of FSHβ on BMP9-induced calcium deposition in C3H10T1/2 cells under light microscopy(100×)

2.4 FSHβ增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化中Notch信號(hào)的表達(dá)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，本研究利用各組腺病毒感染細(xì)胞5 d后對(duì)相關(guān)信號(hào)靶基因 mRNA進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)靶基因Hey1 mRNA的表達(dá)水平顯著增加。如圖4所示，利用Q-PCR方法檢測(cè)后，分析其mRNA表達(dá)水平的相對(duì)定量值。結(jié)果顯示，F(xiàn)SHβ處理組較GFP對(duì)照組Hey1 mRNA表達(dá)無顯著變化，BMP9處理組較GFP對(duì)照組Hey1 mRNA的表達(dá)顯著增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);而BMP9與FSHβ聯(lián)合處理組較BMP9處理組Hey1 mRNA的表達(dá)進(jìn)一步增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，圖4)。提示FSHβ能增加BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中Hey1 mRNA的表達(dá)水平，即Notch信號(hào)的表達(dá)。

圖4 FSHβ對(duì)BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞中Notch信號(hào)靶基因Hey1 mRNA表達(dá)水平的影響。Q-PCR結(jié)果顯示重組腺病毒感染C3H10T1/2細(xì)胞5 d后Hey1 mRNA 表達(dá)水平(n=3，t-test，＊＊ P＜0.0001 vs GFP組;##P=0.0032 vs BMP9組)Fig．4 Effect of FSHβ on the expression of Notch signaling target gene Hey1 mRNA in BMP9-induced mesenchymal stem cells．Q-PCR analysis of Hey1 mRNA levels in C3H10T1/2 cells treated with recombinant adenovirus for 5 d(n=3，t-test，＊＊ P ＜0.0001 vs GFP group;##P=0.0032 vs BMP9 group)．

2.5 DAPT抑制FSHβ增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化中ALP的表達(dá)

為了研究 Notch信號(hào)通路抑制劑DAPT(10 μmol/L)是否能有效抑制FSHβ增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，從而證實(shí)Notch信號(hào)通路在其中扮演著重要作用。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C3H10T1/2細(xì)胞鋪在24孔板中，貼壁后將各組重組腺病毒及DAPT(10 μmol/L)分別按研究計(jì)劃處理細(xì)胞，培養(yǎng)5 d后進(jìn)行ALP染色。如圖5所示，BMP9能顯著增加ALP染色，F(xiàn)SHβ與BMP9聯(lián)合處理組ALP染色則較BMP9單獨(dú)處理組進(jìn)一步增加，而在加入處理因素DAPT后，BMP9與DAPT聯(lián)合處理組ALP染色較BMP9單獨(dú)處理組降低，同時(shí)BMP9與FSHβ、DAPT聯(lián)合處理組較BMP9與FSHβ處理組ALP染色也顯著降低。提示DAPT能抑制BMP9促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用，也能抑制FSHβ增強(qiáng)BMP9促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用，從而反向證實(shí)Notch信號(hào)在FSHβ增強(qiáng)BMP9促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中起到重要作用。

2.6 DAPT抑制FSHβ增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化中Notch信號(hào)的表達(dá)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證 Notch信號(hào)在 FSHβ增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化過程中扮演的重要角色，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C3H10T1/2細(xì)胞鋪在24孔板中，貼壁后將各處理因素按研究計(jì)劃處理細(xì)胞，培養(yǎng)5 d后提取細(xì)胞總RNA，采用Q-PCR檢測(cè)Notch信號(hào)靶基因Hey1 mRNA表達(dá)。如圖6所示，BMP9處理組Hey1 mRNA表達(dá)較GFP處理組顯著升高(P＜0.01)，BMP9與FSHβ處理組Hey1 mRNA表達(dá)較BMP9處理組進(jìn)一步升高(P＜0.05)，而在加入處理因素 DAPT(10 μmol/L)后，BMP9與 DAPT處理組Hey1 mRNA的表達(dá)較BMP9處理組降低(P＜0.05);同時(shí)，BMP9與 FSHβ、DAPT 聯(lián)合處理Hey1 mRNA的表達(dá)也較BMP9與FSHβ處理組降低(P＜0.05)。提示 DAPT能抑制 BMP9促進(jìn)C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化中Notch信號(hào)的表達(dá)，也能抑制FSHβ增強(qiáng)BMP9促進(jìn)C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化中Notch信號(hào)的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)Notch信號(hào)在FSHβ協(xié)同BMP9促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中起著重要作用。

圖5 光學(xué)顯微鏡下各組ALP染色情況(100×)Fig．5 The ALP staining in each group by the light microscope(100×)

圖 6 Q-PCR檢測(cè) DAPT(10 μmol/L)對(duì) FSHβ 協(xié)同BMP9誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化中Hey1 mRNA表達(dá)的影響。Q-PCR結(jié)果顯示不同處理因素處理C3H10T1/2細(xì)胞5 d后Hey1 mRNA表達(dá)水平(n=3，ttest，＊＊P＜0.0001 vs GFP 組;＆P=0.0226 vs BMP9 組;#P=0.0206 vs BMP9組;$P=0.0197 vs BMP9+FSHβ組)Fig．6 Q-PCR detection of the expression of Hey1 mRNA in the osteogenic differentiation of C3H10T1/2 cells induced by FSHβ， BMP9 and DAPT(10 μmol/L)． Q-PCR analysis of Hey1 mRNA levels in C3H10T1/2 cells treated with different processing factors for 5 d(n=3，t-test，＊＊ P＜0.0001 vs GFP group;＆P=0.0226 vs BMP9 group;#P=0.0206 vs BMP9 group;$P=0.0197 vs BMP9+FSHβ group)

3 討論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是臨床上絕經(jīng)后女性常見的骨骼疾病，其防治一直是世界性難題。既往的研究認(rèn)為，絕經(jīng)后女性雌激素水平降低是骨質(zhì)疏松的主要原因，雌激素替代療法可以有效保護(hù)骨質(zhì)流失［31］。然而，伴隨乳腺癌等副作用出現(xiàn)［20］，安全有效的治療藥物亟待解決。近期研究發(fā)現(xiàn)，PMOP除與雌激素水平降低有關(guān)外，也與FSH水平升高有密切關(guān)系:當(dāng)女性FSH水平超過35 IU/L時(shí)，較FSH 8 IU/L的骨密度顯著降低［32］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH可能在骨的生成中發(fā)揮雙重作用，但具體機(jī)制并不明確［24-25］。

間充質(zhì)干細(xì)胞來源廣泛，具有多向分化潛能，自我更新能力強(qiáng)，是目前組織工程骨研究的理想種子細(xì)胞。研究證實(shí)，除破骨細(xì)胞外，間充質(zhì)干細(xì)胞上也有與Gi2α偶聯(lián)的FSH受體(FSHR)的存在，其可能通過ERK1/2磷酸化來抑制其向成骨細(xì)胞方向的分化［20］。然而，與 FSH誘導(dǎo)骨丟失相反的是，在TgFSH小鼠中，升高的FSH能以間接的方式增加骨小梁中的成骨細(xì)胞表面積，從而增加骨的合成代謝，且與雌激素水平無關(guān)［25］;另外，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植可挽救卵巢功能不全所引起的FSH增加［33］。因此，F(xiàn)SH可能對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞存在雙向調(diào)節(jié)作用。此外，BMPs是間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的重要誘導(dǎo)因子，并已有成員被允許用于臨床輔助治療骨折、骨不連等［34］。然而，BMP9作為BMPs中成骨作用最強(qiáng)的成員之一，在動(dòng)物模型中也在促進(jìn)脊柱融合、骨不連修復(fù)中起著重要作用［35］，但相關(guān)機(jī)制有待深入研究。

BMPs對(duì)FSH的作用也受到廣泛關(guān)注，且不同成員對(duì)FSH功能產(chǎn)生不同甚至相反的影響。在母羊垂體中，BMP4能以劑量依賴性的方式通過BMP/SMAD4經(jīng)典途徑抑制FSHβ mRNA表達(dá)，降低FSH濃度［36］;而小鼠垂體細(xì)胞系中，BMP2卻以經(jīng)典BMP信號(hào)途徑方式刺激FSHβ的表達(dá)，且活化素A能協(xié)同刺激其轉(zhuǎn)錄［37］。以上研究表明，BMPs與FSH在不同的種系和細(xì)胞中存在不同的相互作用。BMP9作為BMPs家族的成員之一，且具有較強(qiáng)的成骨誘導(dǎo)功能，筆者猜想，F(xiàn)SH在BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中可能也有作用，但既往的研究著眼于BMP經(jīng)典信號(hào)通路上，對(duì)其他相關(guān)通路的研究并不多見。

Notch信號(hào)通路是五大發(fā)育信號(hào)之一，在血管生成［38］、腫瘤發(fā)生［39］、免疫調(diào)節(jié)［40］中扮演重要作用，也與骨骼發(fā)育密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化［17］，Cao等也證實(shí)Notch在BMP9誘導(dǎo)的成骨分化中起重要作用;此外，Sharff等［41］發(fā)現(xiàn) Hey1在其中發(fā)揮重要作用。因此，本研究猜想，Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑也可能在FSHβ增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中起重要作用。本研究以 MSCs細(xì)胞系 C3H10 T1/2細(xì)胞為研究對(duì)象，將重組腺病毒 BMP9和FSHβ感染細(xì)胞，研究Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在FSHβ增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化過程中的變化，并將該信號(hào)阻斷后反向證實(shí)其在該過程中的重要作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)的FSHβ表達(dá)組對(duì)MSCs中ALP表達(dá)并未產(chǎn)生影響，BMP9卻能明顯增加其表達(dá)，而聯(lián)合處理組則能在BMP9的基礎(chǔ)上使其表達(dá)進(jìn)一步增加，表明FSHβ能增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化(圖2)。在鈣鹽沉積實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)中，結(jié)果呈現(xiàn)相似的變化(圖3)。進(jìn)一步檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路靶基因的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)靶基因Hey1 mRNA表達(dá)，在單獨(dú)的FSHβ處理組較GFP對(duì)照組并未產(chǎn)生影響，而單獨(dú)的BMP9處理組較GFP對(duì)照組則顯著增加其表達(dá)，BMP9與FSHβ聯(lián)合處理組則較BMP9單獨(dú)處理組表達(dá)量增加(圖4)。運(yùn)用DAPT(10 μmol/L)藥物阻斷Notch通路后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行ALP染色發(fā)現(xiàn)，BMP9與 DAPT聯(lián)合作用組較 BMP9作用組ALP染色降低，BMP9、FSHβ和 DAPT聯(lián)合作用組較BMP9和FSHβ聯(lián)合作用組ALP染色也降低，即ALP表達(dá)在加DAPT處理后被逆轉(zhuǎn)，表明DAPT能夠抑制BMP9與FSHβ誘導(dǎo)MSCs的ALP表達(dá)增加(圖5)。進(jìn)一步檢測(cè)Notch信號(hào)靶基因Hey1 mRNA的表達(dá)，BMP9與DAPT聯(lián)合作用組較BMP9作用組Hey1 mRNA表達(dá)降低，BMP9、FSHβ和DAPT聯(lián)合作用組較BMP9和FSHβ聯(lián)合作用組Hey1 mRNA表達(dá)也降低，即Hey1 mRNA表達(dá)在DAPT處理后被逆轉(zhuǎn)，表明DAPT能夠抑制FSHβ增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化中Hey1 mRNA表達(dá)增加(圖6)。因此，該研究證實(shí)，Notch信號(hào)在FSHβ增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化中起重要作用，但涉及的Notch信號(hào)過程中的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。因此，本課題組擬對(duì)Notch信號(hào)通路中涉及的受體、配體和酶等進(jìn)行檢測(cè)，為FSHβ增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化提供具體的機(jī)制，為治療由于絕經(jīng)后卵泡刺激素水平增高引起的骨質(zhì)疏松癥的治療提供可靠的理論依據(jù)。

致謝:感謝重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院骨發(fā)育與再生平臺(tái)對(duì)本研究的大力支持。