補骨顆粒含藥血清對大鼠軟骨細胞凋亡及Trx2信號通路的影響

余光書 林焱斌* 熊國勝 李杰輝 張壽雄 王海洋

1．廈門大學附屬福州第二醫院骨科，福建福州350007

2．福建中醫藥大學研究生院，福建福州350122

3．廈門大學醫學院，福建廈門361102

骨性關節炎是一種以關節軟骨退行性變為主要病理特征的慢性骨關節疾病，其發生發展是多種原因導致成骨細胞與破骨細胞失衡所引起，但發病機制還不甚清楚［1-2］。目前，大多數研究表明軟骨細胞的凋亡在骨性關節炎的發生發展過程中起著重要作用，阻止或延緩軟骨細胞發生凋亡是防治骨性關節炎的一條有效途徑［3-4］。軟骨細胞的凋亡主要有外源性通路和內源性通路，其中線粒體介導的內源性凋亡通路越來越受到關注，而凋亡蛋白酶激活因子引起半胱天冬酶瀑布式活化和細胞凋亡是目前研究的熱點［5］。筆者在既往臨床觀察發現補腎活血中藥能夠有效預防膝骨性關節炎的基礎上，擬從體外細胞實驗研究補腎活血中藥對細胞凋亡的影響，及其對Trx2信號通路的調控作用，以期為進一步研究骨性關節炎的防治機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料

成年清潔型SD大鼠，體重在(180±20)g，雌雄各半，由福建醫科大學實驗動物中心提供(許可證號:SCXK 2016-0002)。膠原酶 II(編號:C8150)、Trx2(編 號:YT4752)、ASK1(編 號:YT0370)、Caspase3(編號:YC006)由北京市普京康利科技有限公司提供，DMEM培養基(編號:180-500)、0.25%胰蛋白酶(編號:TE2004Y)、胎牛血清(編號:TBD11HT)由北京孚博生物科技有限公司提供，PBS緩沖液(編號GT0060)由晶泰公司提供，凋亡試劑盒(編號KGA107)由南京凱基公司提供，中藥顆粒由廈門大學附屬福州第二醫院藥劑科提供。

1.2 實驗步驟

1.2.1 含藥血清的制備:成年SD大鼠10只，雌雄各半，體重在(180±20)g。隨機分為空白血清組和含藥血清組，每組5只。依據臨床常用量按實驗動物與人體表面積折算的等效劑量比值換算，將補骨顆粒用生理鹽水加熱溶解，制成1 g/mL的水溶液。空白血清組予生理鹽水2 mL/kg灌胃，含藥血清組予3.08 g/kg灌胃，每日1次，連續14 d，末次給藥2 h后處死大鼠，并在無菌條件下腹主動脈采血5 mL，靜置2 h后低溫2 000 r/min，離心15 min后分離血清，于56℃恒溫水浴滅活30 min，－80℃冰箱保存。

1.2.2 軟骨細胞的分離與傳代:將大鼠浸泡于75%的乙醇中消毒3 min，取出處死后在無菌條件下解剖出關節軟骨，去盡其他組織后放入有雙抗的PBS液(含青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL)漂洗4～6次，然后將其放入消毒的青霉素小瓶并加入1.5 mg/mLⅡ型膠原酶溶液，在膠原酶小瓶中剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的碎片，封口于37℃水浴鍋內消化30 min，期間不時用手搖瓶，棄去上懸酶液，用DMEM漂洗1～2次，吸盡上清后再加入10倍體積的0.2%Ⅱ型膠原酶，37℃水浴鍋內消化30 min后收集上懸液，如此反復3次，集中所有上懸液，1 000 r/min離心5 min，倒去上清液，沉淀用PBS液洗滌3次，用4 mL含10%FBS的DMEM完全培養液混懸細胞，剩余軟骨片及絮狀膠樣物棄去。將分離好的軟骨細胞接種于25 cm2的培養皿中，置37℃、5%CO2培養箱中培養。24 h后觀察細胞貼壁情況，以后每3 d更換1次培養液。待生長細胞鋪滿培養皿70%～80%時，通過用0.25%胰蛋白酶在37℃溫育1 min將細胞從培養瓶中分離。加入完全培養基，通過3 000 r/min離心5 min收獲細胞，并重懸于培養基中以除去胰蛋白酶。將細胞接種在大培養皿中，4～5 d后獲得原代細胞。在隨后的傳代中每2 d更換培養基，經歷2～5次傳代的細胞用于實驗。

1.2.3 流式細胞術分析細胞凋亡:取第3代軟骨細胞以1×105/cm2接種于培養板中，培養72 h細胞貼壁后“饑餓”培養24 h使細胞同步化。細胞隨機分組后，于A組加入空白血清、B組加入10%含藥血清、C組加入20%含藥血清、D組加入30%含藥血清，繼續培養96 h后收集細胞懸浮液，以PBS洗滌細胞2次后使用胰蛋白酶消化并收集于離心管。在4℃條件下以1 000 r/min離心5 min兩次，然后轉移到專用管，按Annexin V-FITC/PI試劑盒說明進行操作，采用BD FACScalibur流式細胞儀定量細胞凋亡，CellQuest Pro軟件用于分析細胞凋亡情況。

1.2.4 電泳和蛋白質印跡分析:將收集到的細胞通過無菌PBS清洗兩次后再加入適量PBS，用無菌刮刀收集細胞于1.5 mL EP管中，在冰上用含有1 mmol/L蛋白酶抑制劑苯基甲磺酰氟(PMSF)的RIPA緩沖液裂解30 min。在4℃下以12 000 r/min離心10 min，取上清用于蛋白濃度測定(BCA法)。蛋白濃度測定后根據標準曲線計算出各個樣品的蛋白含量，再加入適量5×蛋白上樣緩沖液，調整各個樣品的最終濃度一致后將蛋白樣品煮沸5 min，以12 000 r/min離心1 min后取出上清液放入EP管中，按照SDS-PAGE凝膠配制試劑盒說明書配制4%PAGE凝膠，上樣后先用電壓80 V，約30 min，待蛋白電泳至濃縮膠與分離膠交界處時改用電壓120 V，約60 min。將蛋白轉移至NC膜上，再將NC膜放入現配的5%的脫脂奶粉溶液(2 g脫脂奶粉溶于40 mL 1×TBST中)中室溫搖床封閉2 h。洗膜后加入按稀釋液1∶1000的一抗中，4℃孵育過液。洗膜后放入按稀釋液1∶3000的二抗中，水平搖動，室溫孵育2 h。取出NC膜，TBST洗滌3次，每次10 min。洗膜后使用ECL發光試劑化學顯色后曝光并顯影，使用Image J圖象分析系統測定條帶灰度值，Actin作為內參，取其余組與其比值進行計算。

1.3 統計學分析

采用SPSS 18.0統計軟件分析。各組間的細胞凋亡率比較采用非參數檢驗方法分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 采用膠原酶消化法對軟骨細胞進行分離并進行原代軟骨細胞傳代

從SD大鼠膝關節軟骨組織中分離軟骨細胞，并使用光學顯微鏡觀察培養物。從培養過程中發現原代的軟骨細胞增殖速度緩慢，從第10天開始軟骨細胞的增殖速度才有所加快，約在第15天軟骨細胞才鋪滿80%～90%的培養皿。在原代軟骨細胞貼壁傳代后軟骨細胞貼壁和增殖的速率有所加快，傳代至第2、3代時細胞增殖速度最快，第4代后則呈“去分化”現象，同時還發現在培養過程中梭形狀細胞在逐漸增加。見圖1。

圖1 細胞多為梭形，少數為星形、橢圓形，符合軟骨細胞形態 A:細胞未鋪滿;B:細胞鋪滿后。Fig．1 Most of the cells are fusiform，and a few are star-shaped and elliptical，which conform to the morphology of chondrocytes．A:Not covered by cells;B:Covered by cells．

2.2 使用凋亡檢測試劑盒檢測4組軟骨細胞的凋亡，通過流式細胞術檢測第5天各組的凋亡能力

檢測結果顯示，空白血清組的細胞凋亡率為22.80%，明顯高于含藥血清組(P＜0.05)，而20%含藥血清組(15.91%)與30%含藥血清組(17.93%)的細胞凋亡率又明顯低于10%含藥血清組(21.58%)，各組間的比較具有統計學意義(P＜0.05)。見圖2。

2.3 Western印跡法檢測不同劑量補骨顆粒含藥血清對軟骨細胞Trx2信號通路的影響

通過條帶分析可以觀察到含藥血清組Trx2的表達量都明顯增多，以10%含藥血清組的表達量最多;空白組與10%含藥血清組的ASK1與Caspase3的表達量比20%與30%含藥血清組多。見圖3。通過與Actin內參蛋白比值的統計，可以得到如表1所示的值。

表1 與Actin內參蛋白的比值Table 1 Ratio to Actin of internal reference protein

3 討論

圖2 細胞凋亡散點圖 A:圈定細胞;B:空白血清組;C:10%含藥血清組;D:20%含藥血清;E:30%含藥血清組。Fig．2 Apoptosis scatter plot．A:Delineate cells;B:Blank serum group;C:10%drug-containing serum group;D:20%drug-containing serum group;E:30%drug-containing serum group．

圖3 Western印跡圖Fig．3 Western blot

膝關節軟骨組織內并無血管、神經及淋巴液等供應，因此不能通過自我更新補償丟失的細胞，而是通過增殖來維持成骨與破骨的平衡狀態，但是軟骨細胞的增殖分化速度較慢。筆者在培養過程中發現10 d左右才開始逐漸聚集形成軟骨細胞團集落，而在培養的15 d左右才鋪滿80%～90%的培養皿。因此，研究如何預防軟骨細胞的凋亡具有重要的意義。而軟骨細胞的凋亡由多個基因參與調控，其中線粒體介導的凋亡通路主要是通過呼吸電子漏途徑，引起線粒體跨膜電位降低，導致凋亡蛋白酶激活因子釋放到胞漿，隨之引起半胱天冬酶瀑布式活化和細胞凋亡［6］。其中硫氧還蛋白2(Trx2)是特異位于線粒體的小分子蛋白，它在抗氧化應激、阻止線粒體介導的細胞凋亡等方面發揮著不可忽略的作用［7-8］。

補骨顆粒由骨碎補、鹿銜草、淫羊藿、黨參、茯苓、三七、川牛膝、當歸、川芎、女貞子、枸杞及生地等藥物組成。現代藥理學研究表明，骨碎補、淫羊藿、鹿銜草等補益肝腎中藥可以促進成骨細胞的增殖，抑制破骨細胞的吸收，從而達到預防退行性改變的作用［9-10］。黨參、茯苓等補氣健脾中藥可以提高抗氧化酶的活性，抑制脂質過氧化物的產生，增強運動能力［11］。三七、當歸等活血藥物可以通過調控線粒體信號通路而控制細胞的凋亡［12-13］。由上述可知，補骨顆粒通過“補腎健脾，活血化瘀”的方法可以起到促進細胞增殖與抑制細胞凋亡的功效。本課題研究過程也證實了補骨顆粒可以抑制軟骨細胞凋亡的作用。

硫氧還蛋白2(Trx2)是特異位于線粒體的小分子蛋白，可以與凋亡信號調節激酶-1(ASK1)結合并抑制ASK1的活性，從而抑制凋亡前因子Caspase3所誘導的細胞凋亡［14-15］。本實驗結果也表明補骨顆粒可以促進Trx 2的表達，但是濃度較低時不利于Trx2/ASK1復合物的形成。因此，10%含藥血清組的Trx2與ASK1都明顯高于20%與30%含藥血清組，而ASK1可以激活Caspase 3的表達及其活性，所以空白血清組與10%含藥血清組的Caspase 3表達量明顯多于20%與30%含藥血清組。筆者從流式細胞分析技術中也發現了空白血清組與10%含藥血清組的細胞凋亡率高于20%與30%含藥血清組。因此，筆者認為補骨顆粒含藥血清可以通過調控Trx2-ASK1-caspase 3信號途徑以控制軟骨細胞的凋亡，但是含藥血清需要達到一定合適的濃度，否則不利于Trx 2/ASK 1復合物的形成。