槲皮素對人類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞炎癥因子和基質金屬蛋白酶的表達的影響

賈慶運 王擁軍 梁倩倩 施杞*

1．上海中醫藥大學附屬龍華醫院，上海200032

2．上海中醫藥大學脊柱病研究所，上海200032

3．山東省日照市中醫醫院，山東日照276800

4．筋骨理論與治法教育部重點實驗室，上海200120

5．上海中醫藥大學康復醫學院，上海200120

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是以對稱性多關節滑膜炎癥為主要表現的慢性、進行性、系統性自身免疫疾病［1］。RA的主要病理特征為滑膜細胞的增生、炎性細胞的浸潤，血管翳形成以及由此引發的關節軟骨、骨的破壞，因此，控制RA滑膜細胞炎癥因子及基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)分泌是治療 RA的關鍵［2-3］。槲皮素(quercetin)是一種廣泛存在于自然界的黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、清除氧自由基以及免疫調節等活性。臨床研究表明，槲皮素對緩解膝關節骨性關節炎、類風濕性關節、運動后機體疼痛具有良好的作用［4-8］。因此，本研究通過觀察槲皮素對類風濕性關節炎滑膜細胞的影響，探討槲皮素治療類風濕性關節炎的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞:類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞(MH7A)由中國科學院深圳先進技術研究院張鵬研究員課題組所贈與，細胞來源日本理化研究所細胞 (Tsukuba，Japan)。

1.1.2 試劑及藥物:槲皮素購成都普菲德生物技術有限公司(純度＞98%)，1640培養基(HyClone)，胎牛血清 (fetal bovineserum，FBS)(Gibco)，TNF-α(Pepro TECH)，CCK-8試劑盒(Dojindo)，PCR 引物(華大基因)，RNA提取試劑盒(Qiagen)，RNA逆轉錄試劑盒(TAKARA公司)，電泳液、轉膜液(碧云天)。

1.1.3 儀器:超凈臺、熒光定量PCR儀、酶標儀、細胞培養箱、顯微鏡等。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:MH7A細胞培養于含有10%FBS的1640培養基中，37℃、5%CO2、濕度為100%的恒溫培養箱中培養，每3 d傳代，實驗選擇對數生長期的細胞進行。

1.2.2 實驗方法:(1)CCK-8法檢測藥物對細胞毒性。CCK-8法檢測藥物對細胞的毒性，MH7A細胞按照4×104密度接種于96孔板，不同濃度的槲皮素處理細胞 0、24、48、72 h，每孔加入 10 μL 的 CCK-8試劑，將 96孔板放置于 37℃、5%CO2、濕度為100%的恒溫培養箱中培養1.5 h，酶標儀450 nm、630 nm處測定其吸光度。(2)RT-PCR法檢測炎癥因子。將MH7A細胞系以1×106密度接種于含有2 mL的1640完全培養基的6孔板中，將6孔板放置于37℃、5%CO2、濕度為100%的恒溫培養箱中培養24 h后，50、100 nmol/L的槲皮素預處理MH7A細胞2 h，加入 TNF-α(10 ng/mL)刺激 MH7A細胞24 h，Trizol法提取細胞總RNA，Takara試劑盒反轉成 cDNA，RT-PCR 法檢測 IL-1β、IL-6、IL-8、MMP-1、MMP-3、MMP-13的表達。引物序列見表 1。(3)Western blot法檢測對NF-κB的影響。將MH7A細胞系以1×106密度接種于含有2 mL的1640完全培養基的6孔板中，將6孔板放置于37℃、5%CO2、濕度為100%的恒溫培養箱中培養48 h后，50、100 nmol/L的槲皮素預處理MH7A細胞2 h，加入TNF-α(10 ng/mL)刺激MH7A細胞30 min，細胞蛋白裂解液(RIPA)提取總蛋白，BCA法測蛋白含量，10%SDS-PAGE凝膠電泳，轉移至PVDF膜上，5%BSA封閉2 h，加入一抗室溫孵育2 h，洗膜15 min，二抗室溫孵育1.5 h，洗膜15 min，HRP化學發光顯色、拍照。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3 統計學分析

統計結果采用均數±標準差進行描述，應用SPSS 17.0統計軟件，進行單因素方差分析，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 槲皮素對MH7A細胞毒性的影響

用含槲皮素濃度分別為 0、25、50、100、200、400 μmol/L、0.2%DMSO的 1640完全培養基培養MH7A細胞24、48、72 h后，用CCK-8法測定其對細胞毒性的影響。結果顯示(圖1)，槲皮素濃度為100 μmol/L以下時，實驗組之間以及跟DMSO組相比，無明顯細胞毒性。因此，筆者認為槲皮素在100 μmol/L以下時，對MH7A細胞系無顯著細胞毒性作用。

圖1 槲皮素對MH7A細胞毒性的影響Fig．1 Effect of quercetin on cytotoxicity of MH7A

2.2 槲皮素對TNF-α誘導MH7A細胞炎癥因子及MMPs的影響

MH7A 細胞系在經過(50、100 μmol/L)槲皮素預處理2 h后，使用10 ng/mL的TNF-α進行刺激24 h，提取細胞RNA，用RT-PCR法進行檢測炎癥因子及MMPs的變化。結果顯示(圖2)，槲皮素能夠顯著降低TNF-α誘導的MH7A細胞炎癥細胞因子IL-1β、IL-6、IL-8 和 MMP-1、MMP-3、MMP-13 表達，并呈劑量依賴的特點。

圖2 槲皮素對MH7A細胞炎癥因子及MMPs的影響Fig．2 Effects of quercetin on inflammatory factors and MMPs in MH7A cells

2.3 槲皮素對TNF-α誘導MH7A細胞NF-κB的影響

MH7A 細胞系在經過(50、100 μmol/L)槲皮素預處理2 h后，使用10 ng/mL的TNF-α進行刺激30 min，提取細胞總蛋白，用Western blot法進行檢測磷酸化NF-κB p65的變化。結果顯示(圖3)，槲皮素能夠抑制TNF-α誘導的MH7A細胞 NF-κB p65磷酸化表達，并呈劑量依賴的特點。

圖3 槲皮素對MH7A細胞NF-κB p65磷酸化的影響Fig．3 Effect of quercetin on phosphorylation of NF-kappa B p65 in MH7A cells

3 討論

槲皮素是人類飲食中最主要的生物類黃酮類化合物，廣泛存在于植物的花、葉、果實中［9-10］。槲皮素具有抗炎、抗氧化、免疫調節等作用［11-13］，相關研究表明槲皮素可有效減輕免疫細胞炎癥因子的分泌的作用［14］，這種抑制作用可能和槲皮素因抑制核轉錄因子NF-κB的生物活性相關［15］。相關臨床研究表明，槲皮素對疼痛類疾病的緩解具有良好的作用，對于骨性關節炎、類風濕性關節炎的疼痛的緩解同樣效果良好［5-6，16-23］。

滑膜細胞在類風濕關節炎的發生發展中扮演著重要角色［2］。滑膜細胞可釋放多種炎癥因子［24-25］(IL-1β、IL-6、IL-8)，在 RA 的發病過程中起著關鍵作用，因此抑制滑膜細胞的炎癥因子釋放，可對RA的起到治療作用。MMPs是可降解細胞外基質的鋅依賴性內肽酶，MMPs可降解關節骨與軟骨中的膠原、蛋白多糖及其他的機制大分子，促進血管翳對軟骨的侵襲。滑膜細胞來源的MMPs是導致關節病理損傷的重要因素之一［26-27］，因此，抑制 MMPs的產生，可有效減輕RA關節軟骨及軟骨下骨破壞，延緩骨質破壞的進程。本研究發現槲皮素可有效降低TNF-α 誘導的 MH7A 細胞炎癥因子 IL-1β、IL-6、IL-8和 MMP-1、MMP-3、MMP-13的表達，同時槲皮素可有效降低TNF-α誘導的MH7A細胞NF-κB p65磷酸化表達，因此，推斷槲皮素抑制MH7A細胞炎癥因子和MMPs的表達可能和抑制NF-κB p65磷酸化表達相關。

綜上所述，槲皮素可有效抑制TNF-α誘導MH7A細胞炎癥因子、MMPs的表達和NF-κB p65磷酸化，槲皮素是治療類風濕性關節炎的潛在有效藥物。