新疆江鱈染色體核型分析和形態特征研究

周劍光，蔣艷琳，張 林，王昱斌，張 濤，阿達可白克·可爾江，郭 焱，楊天燕

(1.中國水產科學研究院長江水產研究所，農業農村部水產品質量安全風險評估實驗室(武漢)，武漢 430223；2.浙江海洋大學水產學院，浙江舟山 316022；3.新疆維吾爾自治區水產科學研究所，烏魯木齊 830000)

江鱈(LotalotaLinnaeus)，別名山鯰魚、山懷子，隸屬鱈形目(Gadiformes)鱈科(Gadidae)江鱈屬Lota。江鱈屬于北極淡水區系復合體的魚類，也是鱈科魚類中唯一的淡水經濟種，廣泛分布于北緯45度以北的歐洲、亞洲以及北美洲的內陸水域，在我國僅分布于東北的黑龍江水系、鴨綠江上游以及新疆的額爾齊斯河[1-2]。作為高寒水域冷水性珍稀魚類，江鱈因其肉質鮮美、營養價值高，常被視為美味佳肴，具有較高的經濟價值、藥用價值和特殊的科學研究價值[3-5]。

由于江鱈的自然產量較低且市場消費需求較大，近年來過度捕撈及自然環境改變，導致天然水域江鱈個體趨于低齡化和小型化，且群體數量減少、分布范圍縮小、遺傳多樣性降低，已列入《中國珍稀野生動物名錄》和《黑龍江省地方重點保護野生動物名錄》[6]。目前關于江鱈的研究主要涉及形態測定、繁殖發育以及遺傳變異等方面[7-11]，而對其染色體的研究國內尚未見相關報道。存在于細胞核中的染色體是生物遺傳物質的主要載體，也是細胞遺傳學研究的重要內容[12]。研究魚類染色體及其核型，不僅有助于分析魚類遺傳變異與組成、發育機制以及系統演化等方面的全方位深入了解，也可以對種間雜交和多倍體育種進行預測與鑒定[13]。因此，開展江鱈這一珍稀冷水魚類的染色體核型分析研究，不僅對其種質資源的判別鑒定具有重要意義，也可為其生殖繁衍和人工育種提供理論依據。本研究對新疆額爾齊斯河流域的野生江鱈染色體核型進行測定和分析，研究結果將有助于補充江鱈細胞遺傳學數據信息，同時也為我國高寒水系的魚類遺傳育種及人工繁殖提供參考資料。

1材料與方法

1.1 試驗材料

江鱈于2017年7月采自新疆額爾齊斯河水系的布爾津河流域(圖1)，選取成熟健壯、體表完好、體質良好的活體試驗樣品54尾。用直尺和游標卡尺測量樣品體長、頭長、體高、頭高、吻長、眼徑、眼間距、尾柄長、尾柄高，精確至 0.1 cm；用電子天平測量樣品體質量，精確至 0.1 g。測得樣品體長在20.3～56.1 cm之間，單尾體質量在230.0～1 860.0 g之間。用于江鱈染色體制備的10尾(5雌5雄)樣品于2018年2月采自新疆額爾齊斯河水系的布爾津河流域，單尾體質量在80.5～151.6 g之間。

圖1 采樣地點圖(▲為采樣點)Fig.1 Sampling location of L.lota

1.2 染色體標本制備

染色體標本制備采用林義浩[14]的體內注射腎細胞法，稍作修改，方法如下：(1)實驗前先將江鱈暫養于水族箱中，使水溫以及pH值保持在適宜范圍，將氣石與過濾棉放置于缸內，確保溶氧量充足和水質干凈。(2)注射PHA(植物血球凝集素)：自實驗魚胸鰭基部注射PHA,劑量10～15μg/g(魚體質量)。(3)注射秋水仙素：注射PHA 20～24 h后，每1 g魚體質量注射3～5μg秋水仙素。(4)制備細胞懸液：注射秋水仙素2～4 h后，剪開江鱈的鰓部動脈，放血20 min，取江鱈頭腎,用生理鹽水反復洗滌3～4次，將組織剪碎、過濾細胞懸液，再放入離心管中，以1 200 r/min離心10 min，得到沉淀的江鱈頭腎細胞。(5)低滲處理：往離心管加入5 mL的0.075 mol/L的KCl低滲液，低滲處理50～60 min，再以1 200 r/min的速率離心10 min。(6)固定處理：將預冷新配的卡諾氏固定液(甲醇∶冰醋酸 = 3∶1)，量取5 mL加入到剛棄去上清液的沉淀細胞中，用吸管吹打均勻，固定20 min后再以1 200 r/min的速率離心10 min。再重復固定2次，每次20 min。(7)滴片處理：將細胞懸浮液滴于預冷載玻片上，隨后將載玻片在酒精燈上過火2～3次后放置透風透氣處自然風干。(8)染色處理：將風干的染色體玻片放入濃度為10%吉姆薩(Giemsa)染色液中染色30 min，用蒸餾水將玻片反面沖洗干凈，自然風干后鏡檢。

1.3 染色體眾數確定及組型分析

染色體眾數確定及組型分析參照TAN等[15]方法進行，稍加修改，方法如下：

1.3.1 染色體眾數確定

選取來自不同個體的110個分散良好的細胞，用顯微鏡(油鏡)進行觀察、拍照，根據眾數確定江鱈二倍體染色體數目。

1.3.2 組型分析

挑選 10個數目完整、分散良好、長度適中(正中期)、著絲點清楚、2條染色單體適度分開、形態清晰的分裂相進行顯微攝影，在相片上對每一條染色體確認著絲點位置，分別測量長臂和短臂，測量數據取其平均值。計算其相對長度、臂比值和著絲點指數，并按LEVAN等[16]提出的標準進行配對、分類、排列組型。

2 結果

2.1 江鱈形態特征

2.1.1 外形

江鱈外部形態見圖2所示。江鱈體圓長形，后部側扁。頭稍扁平。體背部及體側上部灰褐色，腹部灰白色，體側與鰭條上散布不規則的黃白色斑點。吻鈍，口端位。下頜略長于上頜。眼小，眼間距平寬。頦部正中具頦須1枚，兩鼻孔分離，前鼻管突出，具鼻須1對。鰓蓋膜分離，不與峽部相連。體被小圓鱗。側線前部較高，后部側中位，且常不完全。背鰭兩個，前背鰭短小，后背鰭基長幾與尾鰭相接。胸鰭扇形。腹鰭喉位，第1～2鰭條略延長呈絲狀。臀鰭基起點稍后于背鰭，后端與尾鰭相接或稍分離。尾鰭橢圓形。

圖2 江鱈外部形態圖Fig.2 Morphological characteristic of L.lota

2.1.2 可數性狀

江鱈背鰭鰭式：D.i～iii-10～13，i～ii-65～92；胸鰭鰭式：P.i-16～17；腹鰭鰭式：V.0-7；臀鰭鰭式:A.0-64～84；左側第一鰓弓外側鰓耙數：8～12。

2.1.3 可量性狀

測量了54尾體長20.3～56.1 cm江鱈的體長、頭長、體高、頭高、吻長、眼徑、眼間距、尾柄長和尾柄高數據，其可量性狀比值見表1。

表1 江鱈可量性狀比值

2.1.4 內部構造特征

江鱈鰾一室，前端分小叉，后部稍大。脊椎骨總數為58～67。腹膜銀白色。

2.2 體長和體質量關系

分析江鱈體長和體質量回歸曲線呈冪函數關系(圖3)，額爾齊斯河江鱈體長與體質量關系符合指數增長形式，二者關系可用公式W=0.016L2.782(R2=0.960)表示。式中W為體質量(g) ，L為體長(cm)。根據回歸方程將各齡魚的逆算平均體長代入體長-體質量關系式，求得各齡魚平均體質量范圍為：2齡魚體質量48.2～530.3 g、3齡魚體質量62.0～678.2 g、4齡魚105.2～935.6 g、5齡魚238.5～1 675.5 g。

圖3 江鱈體長與體質量關系Fig.3 Relationships between body length(L)and body weight(W)of L.lota

2.3 江鱈染色體數目和核型

2.3.1 江鱈二倍體染色體數目

統計10尾江鱈共110個染色體中期分裂相的結果(表2)，其中染色體總數為48的分裂相細胞占全部計數細胞的74.5%，由此確定江鱈的二倍體染色體數目為2n=48(圖4)。

表2 江鱈染色體數目的分布

圖4 江鱈染色體中期分裂相圖譜Fig.4 Metaphase chromosome of L.lota

2.3.2 江鱈的染色體組型

根據對江鱈染色體相對長度和臂比的統計結果(表3)，其全部48條染色體可配成24對，按LEVAN等[16]命名法分成 4組，m組(中部著絲點染色體，r=1.00～1.70)6對；sm組(亞中部著絲點染色體，r=1.71～3.00)9對；st組(亞端部著絲點染色體r=3.01～7.00)7對；t組(端部著絲點染色體，r=7.01～∞)2對。其相對長度最長可以達到6.83±0.31，而最短為2.06±0.17。按相對長度排列，制成江鱈染色體組型圖(圖5)，核型公式為 2n=12m+18sm+14st+4t，臂數(NF)=78。從圖5可以看出，在江鱈的m組中，有一對相對本組其他染色體明顯較大的染色體，除此之外，各相鄰兩對染色體之間無明顯差異，大小呈遞減趨勢排列。4組染色體均未發現帶有特殊標志性特征如隨體、次縊痕的染色體，也未發現與性別決定有關的異形性染色體。

圖5 江鱈染色體核型Fig.5 Karyotype of L.lota

序號相對長度臂比著絲粒指數染色體類型16.83±0.311.13±0.0146.99±0.24m25.00±0.211.47±0.0340.54±0.48m34.64±0.791.37±0.1742.18±2.86m44.05±0.281.54±0.0339.39±0.49m53.91±0.221.23±0.1544.91±2.89m63.85±0.281.35±0.0442.54±0.78m75.27±0.402.32±0.0330.13±0.28sm85.23±0.392.14±0.0131.81±0.05sm95.01±0.072.49±0.0228.63±0.17sm104.38±0.022.12±0.0732.05±0.73sm114.29±0.182.01±0.0533.18±0.53sm124.20±0.582.69±0.0627.07±0.43sm133.77±0.222.13±0.1531.98±1.49sm143.64±0.142.05±0.0132.81±0.15sm153.62±0.112.11±0.0732.19±0.73sm164.36±0.203.22±0.1123.68±0.59st174.34±0.164.10±0.0719.61±0.25st183.93±0.253.52±0.1422.14±0.71st193.74±0.134.14±0.0319.44±0.10st203.74±0.233.39±0.0922.76±0.46st213.44±0.233.44±0.0822.50±0.40st223.29±0.374.13±0.0919.48±0.33st233.42±0.15∞∞t242.06±0.17∞∞t

注：平均值±標準差

3 討論

按照魚類體長-體質量關系曲線方程，當a值越大時魚體越肥碩；b值大于或小于3時，魚類呈異速生長[17]。通過實測數據分析，本研究中江鱈體長-體質量關系式中冪指數值小于3(b=2.782)，表現出體長增長快于體質量增長的異速生長，且推算出的1～2齡魚體長、體質量的相對增長率均高于性成熟時的3～4齡魚，表明江鱈在性成熟前生長速度相對較快，而性成熟后各項指標均呈現下降趨勢，增長變緩，符合一般魚類的生長規律[18-19]。不同地理分布區內的江鱈形態特征存在一定差異。Hubbs等[20]最早提出將江鱈分為江鱈指名亞種(L.lotalota)、細尾江鱈亞種(L.lotaleptura)和北美斑江鱈亞種(L.lotamaculosa)三個亞種，并將胸鰭長度作為指名亞種區分其他兩個亞種的分類特征。按照該標準，新疆額爾齊斯河江鱈被劃為指名亞種，而黑龍江流域的江鱈系統分類地位尚不明確，或許處于指名亞種的邊緣[21]。張俊麗等[11]通過對分布于黑龍江多布庫爾河和新疆額爾齊斯河的江鱈形態特征比較研究發現，38項量度特征和分節特征中有28項達到差異顯著水平(P<0.05)、26項達到差異極顯著水平(P<0.01)，從而進一步證實了二者可能屬于不同亞種。

染色體與核型分析對研究魚類遺傳和進化具有至關重要的意義。化石證據和分子遺傳學資料顯示，作為世界上唯一在淡水中分布的鱈形目魚類，早在5～15百萬年前江鱈就已存在于歐洲的天然水域，并隨后擴散到北美各大水系[22]。Ohno[23]研究認為，具有48條單臂染色體核型的魚類是硬骨魚類中較原始的類群，物種的核型演化主要通過染色體重排(Chromosomal rearrangement)進行。例如，有研究證實染色體臂間倒位(Pericentric inversions)在三刺魚(Gasterosteusaculeatus)對淡水生存環境適應過程中發揮了重要作用[24]，推測江鱈染色體結構在進化過程中可能也經歷了一系列融合、倒位和重組變化，通過增加其染色體臂數以適應淡水生活。

已有的研究表明，二倍體鱈科(Gadidae)魚類染色體數目從寬突鱈屬(Eleginus)的13對到平頭鱈(Ranicepsraninus)、細長臀鱈(Trisopterusminutus)和江鱈(L.lota)的24對不等，染色體臂數也有NF=48和NF=78之別[25]。李樹深[26]通過研究發現，利用著絲粒染色體和臂數數目可以劃分不同魚類類群，具有較多的端部著絲粒染色體的魚類屬于原始類群，而具有較多中部或亞中部著絲粒染色體的魚類則屬于特化類群，染色體臂數多的類群較之臂數少的類群更為特化。通過觀察比較得知，江鱈的染色體臂數較其他鱈科魚類數量多，且具有較多中部與亞中部著絲粒染色體，推測江鱈可能是鱈科魚類中較晚分化出來的，在進化上屬于較為特化的類群。另外，按照腹鰭著生的位置對應魚類在進化中出現的先后順序與物種的地位，腹鰭腹位的魚類屬于較原始的類群，而腹鰭胸位和腹鰭喉位在魚類進化中出現相對較晚，與之對應的魚類進化更完善，并且這些特征的出現增強了相應物種對環境的適應性，較之腹鰭腹位這一早期形式更高級[19]。因此，該角度也從一個側面印證了江鱈在進化上更為特化。