不同年份陳艾的總黃酮、總多糖研究

龔 敏，盧金清

（湖北中醫(yī)藥大學(xué)／湖北省藥用植物研發(fā)中心，武漢 430065）

艾（Artemisia argyi）又名冰臺、醫(yī)草、黃草艾蒿，為菊科蒿屬植物，易繁衍生長，是一味藥用和食用歷史悠久的民俗藥材。入藥多用生艾，灸多用熟艾，又稱陳艾，一般保存一年以上的艾葉謂之陳艾。在許多古籍和民間均有對陳艾的流傳，如《孟子·離婁上》中記載“七年之病，求三年之艾”。艾葉中的活性成分包括揮發(fā)油、黃酮、多糖、有機(jī)酸等，目前針對化學(xué)成分的研究以揮發(fā)油最多。艾葉中的總黃酮和總多糖均具有抗氧化作用［1，2］，此外艾葉 多糖 具有 降 血糖作用［3］，且對體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)功能［4］。試驗(yàn)對不同儲存年份陳艾中的總黃酮和總多糖進(jìn)行含量測定，闡明陳艾中總黃酮和總多糖含量隨時(shí)間變化的趨勢，從科學(xué)的角度完善論證了陳艾的使用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 藥材

藥材采摘于湖北省蘄春縣蘄艾基地，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)張秀橋教授鑒定為菊科植物艾的干燥葉。

1.2 儀器

Sartorius CPA225D型電子分析天平，d＝0.01 mg；JY1002 型電子天平，d＝0.01 g；HH-S4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州普天儀器制造公司；UV-3200型紫外可見分光光度計(jì)，MAPADA儀器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水真空泵。

1.3 試劑

蘆丁對照品 （批號為 YM0316SA13，HPLC≥98%）、無水葡萄糖對照品（批號為B21882，HPLC≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司，95%乙醇、氫氧化鈉、九水合硝酸鋁、亞硝酸鈉、苯酚、濃硫酸等，以上試劑均為分析純。

1.4 總黃酮含量的測定

1.4.1 對照品溶液的制備 精密稱定蘆丁對照品適量于容量瓶中，加60%乙醇稀釋至刻度，精密量取2 mL至5 mL量瓶中，加60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，得 0.25 mg／mL 對照品溶液［5］。

1.4.2 供試品溶液的制備 精密稱定樣品 （剪碎）1.0 g至錐形瓶中，精密加入60%乙醇50 mL，稱定重量，超聲處理（功率 250 W，頻率 40 kHz）0.5 h，放冷，加乙醇補(bǔ)足重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液1 mL置于20 mL容量瓶中，加醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL［6］，分別置于 25 mL 容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，各加水至7 mL，混勻，放置6 min，再加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min；再加氫氧化鈉溶液10 mL，最后加水至刻度，搖勻，放置15 min，以等量水替代供試液為空白校正，紫外-可見分光光度法在510 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 總多糖含量的測定

1.5.1 對照品溶液的制備 精密稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖對照品1.00 mg至10 mL量瓶中，加適量水溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液（每1 mL中含無水葡萄糖0.1 mg）。

1.5.2 供試品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的樣品0.5 g至50 mL燒瓶中，加25 mL水，回流2 h，濾過，濾渣加25 mL水，回流1 h，濾過，合并2次濾液，濃縮至20 mL，加100 mL 95%乙醇至含乙醇量不低于80%，靜置12 h，減壓抽濾，沉淀用熱水溶解，移至50 mL容量瓶中定容，濾過，取續(xù)濾液0.5 mL至10 mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

1.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL［7］，分別置于具塞試管中，分別加水至2.0 mL，各精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密加入濃硫酸5 mL，搖勻，放置10 min，置于40℃水浴中保溫15 min，取出后迅速冷卻至室溫，以相應(yīng)的試劑為空白。按紫外-可見分光光度法在487 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮含量的測定

2.1.1 測定波長的選擇 根據(jù)顯色后對照品溶液和供試品溶液在紫外-可見分光光度的測定，總黃酮對照品溶液與蘄艾中總黃酮制成的供試品溶液在510 nm處均有最大且穩(wěn)定吸收，故選擇測定波長為510 nm。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 按紫外-可見分光光度法在510 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程為A＝11.853 0C-0.001 7（r＝0.999 3）， 蘆丁在 0.009 7～0.048 6 mg／mL 與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.1.3 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率考察為了對該分析方法進(jìn)行綜合評估，進(jìn)行了精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)和加樣回收率試驗(yàn)，RSD值均小于3%，紫外-可見分光光度計(jì)精密度符合要求，供試品溶液在60 min內(nèi)穩(wěn)定，該分析方法可靠、重復(fù)性良好。加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 總黃酮加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.1.4 樣品測定 精密吸取供試品溶液2.0 mL至25 mL 量瓶中，加水至 6.0 mL，照“1.4.3”的方法，自“加5%亞硝酸鈉溶液1 mL”起測定吸光度，同時(shí)取供試品溶劑2 mL，除不加供試品溶液外，其余操作同上，作為空白，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出供試品溶液中蘆丁含量，測定結(jié)果見表2。

2.2 總多糖含量測定

2.2.1 測定波長的選擇 根據(jù)顯色后對照品溶液和供試品溶液在紫外-可見分光光度的測定，無水葡萄糖對照品溶液與蘄艾中總多糖制成的供試品溶液在487 nm處均有最大穩(wěn)定吸收，故選擇測定波長為487 nm。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 經(jīng)計(jì)算，得回歸方程為A＝58.958 0C-0.041 1（r＝0.999 3），葡萄糖在 0.108 9～0.713 8 mg／mL與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.2.3 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率考察為了對該分析方法進(jìn)行綜合評估，進(jìn)行了精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)和加樣回收率試驗(yàn)，RSD值均小于3%，紫外-可見分光光度計(jì)精密度符合要求，供試品溶液在60 min內(nèi)穩(wěn)定，該分析方法可靠、重復(fù)性良好。加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表2 陳艾中總黃酮含量測定結(jié)果

表3 總多糖加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.4 樣品含量測定 精密吸取供試品溶液1.0 mL，加水至 2.0 mL，按“1.5.3”的方法，自“各精密加入5%苯酚溶液1 mL”起測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出供試品溶液中總多糖含量，測量結(jié)果見表4。

3 討論

不同年份蘄艾總黃酮和總多糖含量隨儲存時(shí)間變化趨勢如圖1所示，總黃酮含量逐年升高，第3年到達(dá)峰值，后急劇下降；總多糖含量逐年下降。

已有藥理研究證明，艾葉中的總黃酮和總多糖均具有良好的抗氧化、清除自由基和有效阻止脂質(zhì)過氧化引起細(xì)胞破壞的功效［8］，且不良反應(yīng)較小，有望作為天然抗氧劑甚至發(fā)揮抗癌防癌的作用而得到廣泛開發(fā)應(yīng)用。古有記載，“凡用艾葉，須用陳久者，治令細(xì)軟，謂之熟艾，若生艾灸火，則傷人肌脈”，陳艾應(yīng)用于艾灸的歷史悠久，從傳統(tǒng)艾灸發(fā)展到現(xiàn)代艾灸，傳統(tǒng)艾灸有煙和火，安全性不夠且操作不便，現(xiàn)代艾灸根據(jù)需要在艾條中添加藥物粉末或隔姜、蒜、鹽等使用，應(yīng)用范圍更加廣泛，陳艾灸火燃燒時(shí)艾絨熱力溫和，直達(dá)深部，功效強(qiáng)勁。艾灸產(chǎn)生的煙霧成分復(fù)雜，除揮發(fā)油成分及其氧化產(chǎn)物外［8，9］，還有抗自由基成分［10］，這些具有清除自由基和過氧化脂質(zhì)作用的物質(zhì)包括艾葉中的總黃酮和總多糖成分。隨著儲存時(shí)間的延長，三年陳艾中的總黃酮含量達(dá)到峰值，總多糖含量還未劇烈下降。市面上很多普通消費(fèi)者甚至商家錯(cuò)誤地認(rèn)為艾葉放置時(shí)間越久越好，造成了市場混亂的現(xiàn)象，不利于艾產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，試驗(yàn)從總黃酮和總多糖兩個(gè)方面為三年陳艾的使用價(jià)值提供了佐證，具有一定指導(dǎo)意義。

表4 陳艾中總多糖含量測定結(jié)果

圖1 不同年份陳艾總黃酮、總多糖含量變化趨勢