應力刺激下TGFβ/Smad信號通路介導成骨細胞功能變化的研究

程 燁 呂春曉 李貴鳳 陶貴渝 陳建偉 李 煌

成骨細胞是骨形成的效應細胞，在骨改建的機制中處于“中心調控地位”，被認為是力學信號轉導過程中對應力應變信號進行感知的主要力學敏感性細胞。許多研究顯示，體外培養的成骨細胞在機械應力刺激下會發生基因表達的改變。應力刺激在1小時內就能增加成骨細胞環氧合酶2（COX-2）和c-fos mRNA 的表達水平[1]，24 小時內可提升其細胞外基質蛋白骨鈣素（OCN）及骨橋蛋白的表達[2]。

轉化生長因子β（TGFβ）是一類強力的多功能細胞因子，其主要的生理功能可能包括調控細胞的生長，刺激基質的分泌及免疫抑制。在牽張成骨過程中，TGFβ 是重要的參與者。在多項動物頜骨牽張實驗中發現，TGFβ1 表達在延遲期、牽張期和早期固定期均有增加[3]。本課題組的前期研究通過生長期山羊骨縫牽張的實驗發現，骨縫邊緣出現大量成纖維細胞和成骨細胞，BMP 和TGFβ 在這些增殖活躍的細胞中呈高水平表達[4]。體外研究發現，由破骨細胞釋放激活的TGFβ 可以通過活化成骨前體細胞并刺激其增殖而增加成骨細胞的數量來刺激骨的形成[5，6]。

成骨細胞中Ⅰ型膠原（COL-I）的表達始于增殖期，基質合成期達到高峰；堿性磷酸酶（ALP）是成骨細胞早期分化標志物，基質合成期開始表達，鈣化期達到高峰；OCN 是成骨細胞成熟標志，從鈣化早期開始表達，鈣結節成熟后達高峰。功能性Runx2 水平決定了骨骼成熟程度及轉換率。Runx2 存在于增殖活躍的成骨細胞細胞前體中，并在細胞開始分化時表達最高，Runx2 通過使細胞退出細胞周期和激活骨細胞表型基因促進成骨細胞分化成熟[7，8]。因此，OCN、COL-I、ALP 和Runx2 是判定成骨細胞功能活性的重要指標。

大鼠腭中縫牽張實驗顯示，骨改建活躍區域細胞TGFβ/Smad 信號分子表達水平發生變化[9]。然而，在此過程中，各類細胞的功能活動改變及機制仍未得到全面詳細的描述。為了更深入的了解這一系列細胞分子事件的機械感應機制，我們對機械張應力作用下成骨細胞增殖活性，TGFβ/Smad、OCN、COL-I、ALP 和Runx2 等表達變化規律及可能機制進行了研究。

資料和方法

1.成骨細胞體外張應力加載模型：本實驗使用的成骨細胞為MC3T3-E1 小鼠成骨細胞株，在含10%胎牛血清的α-MEM 培養基中常規培養。

成骨細胞按4x105/ml 密度接種于消毒后的加力板中心區域，48 小時后，將培養基換為無血清的α-MEM 培養液繼續培養24 小時，以同步化成骨細胞細胞周期。

采用Focrel 四點彎曲體外細胞加力儀器，頻率為0.5Hz，加力板變形量為2000μstrain，按0h（未加力），lh，3h，6h，12h，24h 不同時間，使細胞發生單軸牽張應變（圖1），加力結束后按組收集細胞。對照組細胞不加力。

圖1 Focrel 四點彎曲體外細胞加力裝置

2.成骨細胞增殖活性分析：各組細胞加力結束后，取出加力板，消化收集加力板上的成骨細胞并固定。釆用流式細胞儀（Beckman Coulter）檢測細胞DNA 含量，計算各樣本中 G0/G1 期、S 期、G2/M 期細胞百分比。增殖指數（PI）反映了細胞群體的增殖活性和DNA 合成速度，分別計算各組的PI 值。PI＝（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）×100%

3.TGFβ/Smad 及成骨分化相關因子表達檢測：①細胞總RNA 提取：按照TRIzol 試劑盒（Invitrogen公司，美國）說明書步驟進行細胞總RNA 的提取，提取所得的總RNA 經瓊脂糖凝膠電泳質檢合格后備用。②引物設計與合成：根據GeneBank 中小鼠TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TGFβR Ⅰ 、TGFβR Ⅱ 、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7、OCN、ALP、COL-I 和Runx2 基因和GAPDH 管家基因序列設計引物，引物由生工生物工程（上海）有限公司設計合成（表1）。③逆轉錄合成cDNA：采用Takara PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser 試劑盒（Takara公司，日本）在FTC2000PCR 合成儀上進行逆轉錄。④實時聚合酶鏈反應（RT-PCR）：采用 Takara SYBR? Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）試劑盒（Takara 公司，日本）配置反應體系，在ABI PRISM ? 7300 Fast Real-Time PCR System（Applied Biosystems 公司，美國）進行檢測，擴增條件均為：95℃，30s（預變性）；95℃，5s，60℃，31s，40個循環（PCR 反應）。⑥統計分析：實驗結果以平均值±標準偏差的形式表示。采用SPSS17.0 軟件包，對PCR 結果在各個時間點進行單因素方差分析，并在此基礎上應用LSD 法進行兩兩比較，規定P＜0.05 有統計學差異。

表1 RT-PCR 引物序列

結 果

1. 成骨細胞增殖活性：隨著加力時間的增加，G0/G1 期細胞所占比例呈下降趨勢；S 期細胞比例在1h，3h，6h 組呈上升趨勢，12h 組出現明顯下降，而24h 組比上一階段明顯增高；G2/M 期細胞比例在1h，3h，6h 組不斷減小，12h 組明顯升高，但24h 組再次降低（圖2）。

PI 指數隨應力加載時間增加而呈上升趨勢。除1h 與3h 組外，其他各時間點間PI 指數差異均具統計學意義。0h，1h，3h 加力組與對照組差異無統計學意義，6h，12h，24h 組差異具有統計學意義（圖2）。

圖2 張應力加載不同時間點細胞周期及增殖指數變化

2. 總RNA 樣本質檢結果：各組總RNA 樣品28S、18S、5S 三條帶清晰，OD260/OD280 比值均介于1.9 至2.0 之間，表明RNA 有良好的完整性和純度，無降解及蛋白質等污染，符合逆轉錄要求（圖3）。

3. 機械張應力刺激下成骨細胞ALP、OCN、Runx2、COL-I 及TGFβ/Smad mRNA 的表達：成骨細胞在受力3h、6h 后，其TGFβ1 mRNA 表達水平持續上升，受力12h 后，略有下降但仍明顯高于0h對照組，加力24h 后，其表達達到頂峰。TGFβ2 mRNA 表達水平在加力3h 后明顯上調，但6h 組，其表達與0h 對照組持平，12h、24h 組其表達再次上升。TGFβ3 mRNA 的表達一直持續在較低的水平，加力6h，其表達明顯降低，12h 時略高于對照組，但24h 組再次下降。TGFβRⅠ的基因表達在加力3h后顯著上升，6h 時受到明顯抑制而下調，但隨著加力時間的延長，其表達再次升高，24h 時，達到高峰。TGFβRⅡ的表達變化趨勢與TGFβRⅠ類似，即6h時受到抑制，但其24h 組的表達低于12h 組（圖4）。

Smad2、3 具有一致的表達變化規律，即加力后3h，表達均上調，6h 時其表達水平與0h 對照組無差異，隨著加力時間的增加，其表達水平持續上調，且Smad3 的表達水平在24h 組明顯升高。Smad4 在短時加力組的表達水平與對照組無統計學差異，但仍有3h 組表達上升，6h 組受抑制的趨勢，在12h，24h組，其表達明顯上調。Smad7 在加力各時間點均有較高表達，其高峰位于3h 組。隨后逐漸降低，24h 時，略有回升（圖4）。

ALP、OCN、Runx2 和COL-I 在加力后3h，基因表達明顯上調均高于對照組，但6h 時，其表達受到不同程度的抑制，隨著加力時間的增加，其mRNA表達水平呈上升趨勢且遠遠高于對照組（圖4）。

圖3 各組總RNA 電泳質檢

圖4 張應力加載不同時間點成骨細胞TGFβ/Smad、ALP、OCN、Runx2 及COL-I mRNA 表達變化（*表示與對照組有統計學差異）

討 論

在外界機械力刺激下，成骨細胞的反應是骨組織發生骨改建及再生重建的源泉。成骨細胞是對應力應變信號進行感知轉導的主要力學敏感細胞，可以通過多種途徑感受體內外力學刺激，并將其轉化為生物化學信號，介導力相關敏感基因的表達，合成各種酶類等活性物質，從而激活信號網絡級聯反應，促成一系列復雜的生理病理活動[10]。因此，了解成骨細胞的生物學行為，尤其是在機械應力作用下，其行為的變化規律及機制，對于我們研究機械力作用下，骨骼的改建及再生，具有極其重要的意義。

關于應力刺激對細胞增殖周期的影響，經過無血清培養基培養24h 后，大部分細胞位于G0/G1期。隨著加力時間的增加，處于G0/G1 期的成骨細胞比例逐漸下降，提示在這一過程中，進入細胞周期的細胞逐漸增加。加力24h 后，仍有約50%的細胞處于G0/G1 期，這部分細胞可能與維持生物學功能有關。加力1h，3h，6h 后，S 期細胞比例穩定增加，說明在短時應力刺激下，細胞的DNA 合成復制增加。12h 組中，S 期細胞明顯減少而G2/M 期細胞比例上升，說明在應力加載12h 后，細胞順利進入了分裂期。24h 組，S 期細胞比例再次增加，提示細胞進入了下一次的有絲分裂期。PI 指數顯示，隨著張應力加載時間的增加，細胞的增殖活性增強。但1h 和3h組PI 指數差異無統計學意義，證明在短時應力刺激下，細胞的增殖活性變化不明顯，故在后續研究中，我們采用了0h，3h，6h，12h 和24h 作為觀察點。

TGFβ 信號通路在軟骨內成骨的形成中具有十分重要的作用。Smad 分子作為TGFβ 在細胞內的重要信號轉導分子，其在成骨細胞中的表達及機制的報道遠遠少于TGFβ 及其受體。本研究結果顯示，張應力作用下3h 組成骨細胞TGFβ1、2 表達上調，而TGFβ3 的表達無明顯變化。加力6h 后，TGFβ1 仍維持較高的表達水平，而TGFβ2、3 的表達則受到了明顯的抑制。隨著加力時間的延長，TGFβ1、2 的表達回升，并高于對照組，而TGFβ3的表達仍處于較低水平。對成骨樣細胞的體外培養實驗發現，TGFβ 對其具有直接的、強有力的趨化作用，同時，TGFβ 是強有力的有絲分裂原， 能刺激成骨細胞及軟骨細胞的增殖，使細胞外基質蛋白和膠原合成增加并抑制其降解[11～14]。結合本實驗結果，我們推測：TGFβ1、2 對于成骨細胞在機械力刺激下增殖活性的增加具有十分重要的作用，尤其是TGFβ1，其表達規律與細胞S 期比例的增加趨勢基本一致。而TGFβ2 除在6h 組表達下降外，在其余各加力時間點均維持較高的表達水平。顱骨縫組織塊體外實驗證實，外源性TGFβ1、2 能促進骨縫細胞增殖、成骨，并最終導致其閉合；而外源性TGFβ3 則會降低細胞DNA 的合成，維持骨縫的開放，在去除TGFβ3 后，細胞DNA 合成增強，骨縫融合[15]。由于顱骨縫的發育主要為膜內成骨，因此我們可以推斷，在應力刺激下，成骨細胞TGFβ1、2 的高表達是其增殖指數上升的原因之一。而TGFβ3 的低表達也印證了其雖然與TGFβ1、2 使用同樣的受體，卻具有不同的生物學效應。

TGFβRⅠ、Ⅱ的表達趨勢與其配體基本一致。體內及體外研究發現，TGFβRⅠ的失活會導致成骨細胞早期分化標志物Runx2、Osterix 和ALP 表達的降低。Smad2、3 具有類似的表達規律，在12h 和24h組，其表達維持較高水平，尤其是Smad3。其表達規律基本與其配體TGFβ1、2 一致。同時，Smad2、3 表達規律的細微差異提示我們兩者在這一過程中發揮作用的機制及時序可能存在差異。研究顯示，Smad2能夠完成Smad3 在軟骨形成早期的大部分功能，但是Smad3 通過調節TGFβ 信號通路抑制軟骨細胞的終末分化從而維持軟骨的內穩定。Smad4 作為唯一的通用型Smad 分子，是TGFβ 信號通路的中心介導者。本實驗中，Smad4 在短時張應力作用下，具有較穩定的表達，但隨著加力時間增加，其表達明顯上調。這一表達規律與TGFβ1、2 及Smad2、3 的變化趨勢基本一致。因此我們認為，在機械張應力刺激下，TGFβ/Smad 經典信號通路參與了機械應力對細胞的增殖和早期分化的調控。

Smad7 對TGFβ 介導的細胞作用具有重要的調控作用，如細胞增殖與細胞周期阻滯、細胞凋亡和上皮細胞向間充質細胞轉變等。在張應力作用下，Smad7 加力后3h 即出現了較高的表達，并隨著加力時間的延長而逐漸下降。I-Smads 能夠受TGFβ 超家族成員比如TGFβ、Nodal 和BMP 等的誘導而表達，因此形成一個負反饋的機制[16，17]。本實驗中，在張應力作用下表達上調的TGFβ 及Smad2、3 和4可能激活了Smad7 的負反饋作用，其在應力刺激前期的高表達，可能是成骨細胞在1h、3h 增殖活性變化不明顯的主要原因之一。隨著加力時間的增加，其表達下調，成骨細胞增殖指數明顯增大。但在24h組，其表達較12h 組有所上升，這可能與細胞進入下一個有絲分裂期，其表達變化受前一階段細胞分裂的影響有關。由于Smad7 對于TGFβ 和BMP 均有抑制作用，并且參與了多條信號通路的串話，因此，需要更深入的實驗來闡明整個作用機制。

本實驗對成骨細胞在張應力作用下，ALP、OCN、Runx2 及COL-I mRNA 的表達進行了檢測，發現在牽張力作用3h 后，成骨細胞上述基因表達均被上調，這一結果與以往研究一致。在加力后6h，上述基因的表達均下降。這可能是由于持續力作用下，細胞形變達到一定程度，對力學刺激的敏感性降低，而出現了不應期。隨著加力時間的延長，上述成骨細胞分化標志物mRNA 表達水平再次上升，并遠遠高于對照組，提示牽張力能誘發成骨細胞的分化成熟趨勢，從而影響了細胞基質合成及礦化。