口腔鱗狀細胞癌中ABCE1與RNase L的表達及意義

姜未來 毛立民 王海霞 劉樂天

口腔鱗狀細胞癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，占口腔頜面部惡性腫瘤的90%以上[1，2]，因此，尋找到與口腔鱗狀細胞癌發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的因子，并揭示出其參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制尤為重要。三鱗酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運子E1 蛋白（簡稱ABCE1）是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白E 亞家族的成員之一，可與核糖核酸酶L（RNase L）特異性結(jié)合，抑制細胞內(nèi)RNase L的活性[3，4]，進而阻斷2-5A/RNase L 通路，該通路在降解腫瘤RNA、促進腫瘤細胞凋亡等方面都發(fā)揮著重要作用[5～7]，抑制該通路在一定程度上抑制了腫瘤細胞的凋亡。近年的研究表明：ABCE1 的異常表達與惡性腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移有關(guān)[8，9]。因此，ABCE1 及RNase L 的表達量異常可作為判定腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要指標(biāo)之一。目前，這兩種蛋白的表達在食管鱗癌[10]、肺癌[11]、膀胱癌[12]、前列腺癌[13]等腫瘤中的研究已有報道。本實驗通過觀察ABCE1 及RNase L 在口腔鱗狀細胞癌中的表達，探究其表達異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

資料和方法

1.臨床資料：取2016 年9 月～2018 年1 月哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科存檔的口腔鱗癌組織蠟塊60 例，患者年齡在44～77 歲，其中男性36例，女性24 例；發(fā)生于舌部23 例、牙齦11 例、口底8 例、頰部8 例、腭部7 例、唇部3 例；高分化25 例，中分化22 例，低分化13 例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的24 例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的36 例；所有患者均為原發(fā)腫瘤，術(shù)前均未行放療、化療及其他治療等。正常口腔黏膜組織25 例，均取自阻生齒拔除術(shù)中切下的正常遠中齦瓣組織，作為對照組。

2.試劑及儀器：兔抗人ABCE1 單克隆抗體（購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司），鼠抗人RNase L 單克隆抗體（購自圣克魯斯生物技術(shù)有限公司），PV-6001 試劑盒，PV-6002 試劑盒及DAB 顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。電烤箱、通風(fēng)櫥、顯微鏡等均由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實驗室提供。

3. 免疫組化染色：65℃烤箱中放入病理切片45min，二甲苯脫蠟30min，梯度酒精脫水5min×3次，水洗兩遍，置入現(xiàn)配3% H202中10min，蒸餾水洗三遍，檸檬酸鈉抗原修復(fù)，水洗兩遍，PBS 沖洗5min×3 次，37℃山羊血清封閉液封閉30min。取出后滴加單克隆抗體ABCE1（1：50）、RNase L（1：200），4℃恒溫過夜。次日，37℃復(fù)溫45min，PBS 沖洗5min×3 次，滴加二抗，37℃30min,PBS 沖洗3min×3 次，DAB 顯色，蒸餾水沖洗5min×2 次。蘇木素復(fù)染，自來水沖洗5min×2 次，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

4.結(jié)果判讀：免疫組化檢測的ABCE1 及RNase L 主要存在于口腔鱗癌細胞的細胞質(zhì)中，以細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞。其表達程度按Sinicrop 的標(biāo)準(zhǔn)作為組織化學(xué)計分：H＝N×I。若H＞1 為陽性,H≤1 則為陰性。陽性細胞數(shù)百分率（N） 共分為5 個等級：＜5.0%；5.0%～25%；25%～50%；50%～75%；75%～100%。著色強度計分（I）：無染色為0 分；淺黃色為1 分；棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。

5.統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件，統(tǒng)計ABCE1 及RNase L 的表達率及相關(guān)臨床信息，資料采取χ2檢驗，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。采用spearman 秩相關(guān)系數(shù)分析相關(guān)性，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.ABCE1 及RNase L 在口腔鱗癌及正常口腔黏膜組織中的表達：ABCE1 及RNase L 的表達主要集中于細胞質(zhì)中，染色呈棕褐色。在口腔鱗狀細胞癌中呈現(xiàn)高表達，在正常組織中表達極少或無表達（圖1、2）。ABCE1 及RNase L 在口腔鱗狀細胞癌中的表達量高于正常口腔黏膜組織（P＜0.05）（表1）。

表1 ABCE1 與RNase L 在口腔鱗癌（0SCC）及正常口腔黏膜組織中的表達

2.ABCE1、RNase L 的表達與口腔鱗癌臨床病理因素分析：60 例口腔鱗癌患者中，ABCE1 及RNase L 的表達水平與性別、年齡、吸煙史無明顯差異（P＞0.05）。而與分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），（表2）。

圖1 ABCE1 在口腔鱗癌 正常口腔黏膜中的表達（ ×200） 中的表達（ ×400）

圖2 RNase L 在口腔鱗癌 正常口腔黏膜中的表達（ ×200） 中的表達（×400）

表2 ABCE1 與RNase L 表達與口腔鱗癌臨床病理特征的關(guān)系

表3 ABCE1 和RNase L 在口腔鱗癌組織中表達的相關(guān)性

3.ABCE1 與RNase L 在口腔鱗狀細胞癌中表達的相關(guān)性：采用Spearman 秩相關(guān)系數(shù)檢驗，結(jié)果顯示60 例口腔鱗癌患者中，ABCE1 與RNase L 在口腔鱗癌中表達無明顯相關(guān)性（P＞0.05），（表3）。

討 論

ABCE1 最初被稱為RNase L 抑制因子，可與RNase L 特異性結(jié)合，使RNase L 的活性降低，抑制了2-5A/RNase L 通路，使腫瘤細胞的轉(zhuǎn)錄、翻譯失去控制，導(dǎo)致腫瘤的增殖分化能力顯著增強[14]。口腔惡性腫瘤與正常組織有諸多不同，其中之一就是腫瘤組織具有局部侵襲和轉(zhuǎn)移特性，而細胞骨架的異常改變已成為反映腫瘤細胞的這些惡性生物學(xué)行為的特征之一[15]。細胞骨架的改變使細胞形態(tài)及細胞粘附能力得以改變，與癌細胞的浸潤、侵襲及遷移密切相關(guān)。β-肌動蛋白是細胞骨架的主要成分，ABCE1 能與β-肌動蛋白相互作用導(dǎo)致細胞骨架的結(jié)構(gòu)異常[16]進而影響細胞的形態(tài)、運動、及細胞內(nèi)外的信息傳遞，從而增強了腫瘤細胞的侵襲、遷移能力[17]。細胞黏附因子是一類介導(dǎo)細胞與細胞、細胞與細胞外基質(zhì)間黏附作用的細胞膜表面蛋白。E-cadherin 主要介導(dǎo)同型上皮細胞間的黏附，其異常也可導(dǎo)致細胞間的粘附力減低或喪失，有助于細胞的分離移動而獲得轉(zhuǎn)移潛能。此外，E-cadherin 的低表達還與腫瘤的分化及低的生存率有關(guān)[18，19]。而ABCE1 能特異性抑制E-cadherin 蛋白的表達，限制其發(fā)揮細胞間的粘附作用，促進了腫瘤細胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移[20]。由此可見，ABCE1 在組織中的表達量增高對腫瘤的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移有促進作用。

RNase L 是一種在干擾素抗病毒作用過程中非常重要的核酸內(nèi)切酶，近年來也被用于腫瘤方向的研究。RNase L 在2-5A/RNase L 途徑中扮演著重要角色，哺乳動物細胞內(nèi)存在無活性的RNase L，它的活化有賴于2-5A，而2-5A 的形成受2-5A 合成酶的調(diào)節(jié)，此酶可被腫瘤RNA 的激活，激活后的RNase L 可迅速降解病毒及腫瘤細胞轉(zhuǎn)錄翻譯生成的RNA[21]。此外，活化的RNase L 亦可將完整的核糖體降解為不完整的形式，在一定程度上誘導(dǎo)病毒感染的細胞及腫瘤過度增殖的細胞凋亡，將病毒感染和腫瘤生長限制在一定區(qū)域內(nèi)。因此，RNase L 在抗病毒、抗腫瘤，誘導(dǎo)細胞凋亡，調(diào)節(jié)RNA 穩(wěn)定性及代謝方面都發(fā)揮著重要作用[22，23]。在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中也常常伴隨著RNase L 含量的異常變化。

本次研究驗證了在口腔惡性腫瘤中ABCE1 的表達量增加，高于正常口腔黏膜組織，腫瘤組織中的RNase L 的表達量高于正常組織。實驗結(jié)果還說明口腔鱗癌中ABCE1 及RNase L 的含量與患者年齡、性別、吸煙史無明顯關(guān)系（P＞0.05），而與腫瘤的分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），且腫瘤的分化程度越低，二者的表達量越高。此外，實驗發(fā)現(xiàn)在口腔癌中ABCE1 及RNase L 兩者的表達量之間無明顯關(guān)系，這可能與RNase L 蛋白的表達受2-5A 及ABCE1 的的雙向調(diào)控有關(guān)，在腫瘤組織中RNase L 的活性雖然被ABCE1 部分抑制，但受RNA 的刺激2-5A 仍可活化RNase L 并促進其在細胞中表達量的增加。