黑小麥阿拉伯木聚糖酶提工藝優化及抗氧化活性研究

付元芳，陳卓昀，曾凡航，王舒婷，韓國全，王利娜，陳 洪*

（1.四川農業大學食品學院，四川雅安 625014；2.四川省成都市食品藥品檢驗研究院，成都 610000）

阿拉伯木聚糖（arabinoxylan，AX）是膳食纖維的主要組成成分。研究表明，AX 具有降低血清膽固醇、降低餐后血糖反應、預防腸道疾病和控制體重等功能，在食品領域有廣泛的應用[1-4]。黑小麥作為一種黑色食品，相對于一般小麥而言，含有更為豐富的膳食纖維，是AX 的優質來源，具有較大的研究價值[5-6]。

近年來酶技術在多糖提取方面應用較廣泛，然而用酶提取黑小麥中AX 的報道有待增加，酶提后剩余殘渣的再次利用更需要進一步加強。由于纖維素酶能夠消化細胞壁β-葡聚糖并打破AX 與β-葡聚糖之間的非共價鍵而釋放AX；木聚糖酶作為細胞壁物質的分解酶，可使黑小麥細胞壁發生降解，破壞細胞壁結構從而釋放AX。所以本試驗選用這兩種酶提取黑小麥中AX。由于從細胞壁中徹底提取AX 需要較為劇烈的條件，而酶提條件比較溫和。因此，本試驗分別使用超聲輔助木聚糖酶提取黑小麥中 AX（xylanase extract arabinoxylan，XAX）及纖維素酶提取黑麥中的AX（cellulase extraction arabinoxylan，CAX）。酶提之后分別用堿處理兩種酶提渣（XAX-1，CAX-1）。有研究表明[7-9]，AX 具有較強的抗氧化性并且不同處理方式對AX 的抗氧化性有影響，因此本研究對所得四種AX 進行抗氧化性研究，旨在提高AX 得率的同時比較不同提取方法對所得樣品抗氧化性的影響，為今后的相關研究提供更多可用資料。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料及試劑

黑小麥（黑寶石1 號，宏兵生態農場提供）。

木聚糖酶、纖維素酶、中性蛋白酶、糖化酶：上海瑞永生物技術有限公司；α-淀粉酶：北京奧博星生物技術有限責任公司；NaOH 溶液、無水乙醇、FeCl3等均為分析純。

1.1.2 儀器設備

LDP-500A 高速多功能搖擺粉碎機（浙江永康紅太陽機電有限公司）、JA3003 電子天平（上海浦春計量儀器有限公司）、DZKW-4 電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業儀器有限公司）、Thermo Sorvall ST 16 ST16R 通用臺式離心機（賽默飛世爾科技公司）、Heto PowerDry PL3000 凍干機（賽默飛世爾科技公司）、RE-52AA 旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）、KQ-250KB 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料的預處理

將黑小麥置于烘箱，40 ℃烘12 h，粉碎，過40目篩。將過篩后的黑小麥粉在鼓風干燥箱中110 ℃加熱90 min 滅酶。去淀粉（加入4%的α-淀粉酶，60 ℃水浴2 h）、去蛋白（加入1%的中性蛋白酶，40 ℃水浴 1.5 h），60 ℃烘干備用[10]。

1.2.2 提取工藝流程

預處理原料→超聲輔助酶法提取→滅酶→離心（4 000 r/min，15 min）→上清液→透析→濃縮→冷凍干燥→AX。

1.2.3 阿拉伯木聚糖得率計算[11]

1.2.4 木聚糖酶提取單因素試驗過程

稱取5 g 原料，分別考察木聚糖酶用量（10、20、30、40、50 mg）、超聲時間（20、40、60、80、100 min）、超聲溫度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃）、超聲功率（100、125、150、175、200、225、250 W）對 XAX 得率的影響[12]。

1.2.5 響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上，以酶用量、超聲時間、超聲溫度、超聲功率為自變量，XAX 得率為響應值，采用 Box-Behnken 響應面設計原理[13]，以XAX 得率為指標，采用DX 8.0 分析軟件進行設計。因素水平表見表1。

1.3 纖維素酶提取AX

取預處理的黑小麥粉5 g，加入100 mL 含有42 mg 纖維素酶的50 mmol/L 的醋酸鈉緩沖液中，在超聲溫度為50 ℃，超聲功率225 W 的條件下提取100 min，滅酶，離心取上清液，透析，濃縮，冷凍干燥，得到 CAX[11]。

表1 響應面分析試驗因素水平表Table 1 response surface analysis test factor level table

1.4 殘渣堿提AX

木聚糖酶與纖維素酶提取AX 后剩余的殘渣在烘箱中60 ℃下干燥12 h，然后參照張曉娜的方法[14]提取AX。木聚糖酶與纖維素酶提取后殘渣用堿提取所得分別為XAX-1 和CAX-1。

1.5 阿魏酸含量測定

取5 mg 阿魏酸標品，溶于0.05 mol/L、pH 7 的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），定容至50 mL 得100 μg/mL 阿魏酸標準溶液，后用PBS稀釋成 2、4、6、8、10、12 μg/mL 的梯度標準溶液，以PBS 為空白，在290 nm 波長處測吸光度，建立標準曲線，將4 種AX 用PBS 配制成一定質量濃度的溶解液，測阿魏酸含量，每個樣品測量3 次取平均值[15]。

1.6 AX的抗氧化性分析

通過測定 XAX、CAX、XAX-1、CAX-1 的·OH清除率[16]、DPPH·自由基清除率[17]、O2-·清除率[18]、還原力[19]及鐵離子螯合能力[20]來評價其抗氧化活性。

1.7 數據統計分析

所有試驗重復3 次。采用SPSS 21 分析軟件對試驗數據進行統計分析，以P＜0.05 為顯著性標準。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 木聚糖酶用量對XAX 得率的影響

由圖1知，隨木聚糖酶用量的增加，XAX 得率先升高后降低，當木糖酶的用量為30 mg 時，XAX得率達到最大為2.26%。這是因為木聚糖酶是分離XAX 的關鍵酶類型，其可以打破木聚糖主鏈，使XAX 增多，當木聚糖酶量達到一定值時會降解XAX 成單糖，使XAX 得率降低。

2.1.2 超聲時間對XAX 得率的影響

由圖2可知，隨著超聲時間的延長，XAX 得率呈先上升后下降的趨勢，當超聲時間為80 min 時，XAX 得率達到最大值2.74%。可能是超聲時間過短，XAX 沒有完全溶出，隨著時間的延長XAX 不斷被溶出，當超聲時間過長時，XAX 會在超聲剪切力的作用下發生水解，使XAX 得率下降[21]。

圖1 木聚糖酶用量對XAX 得率的影響Figure 1 Effect of the use of xylanase on the extraction of XAX

圖2 超聲時間對XAX 得率的影響Figure 2 Effect of ultrasonic time on extraction of XAX

2.1.3 超聲溫度對XAX 得率的影響

從圖3可知，隨著超聲溫度的升高，XAX 得率先上升后下降，當超聲溫度為60 ℃時，XAX 得率達到最大值3.66%。可能是隨著溫度的升高，XAX 分子運動加劇，使得溶質擴散的速率加快，從而使細胞內的XAX 溶出，但當溫度過高，酶的活性降低，使 XAX 得率降低[22]。

2.1.4 超聲功率對XAX 得率的影響

由圖4可知，當超聲功率低于175 W 時，XAX得率隨超聲功率的增大而增加，高于175 W 時，XAX 得率隨超聲功率的增加而降低。這可能是隨著超聲波功率的增大，分子擴散速度加快，使得XAX越容易溶出，當超聲功率過高時，超聲波的空化作用過強，使得提取的XAX 發生降解，導致XAX 得率下降[23]，因此超聲功率選擇175 W。

圖3 超聲溫度對XAX 得率的影響Figure 3 Effect of ultrasonic temperature on extraction of XAX

圖4 超聲功率對XAX 得率的影響Figure 4 Effect of ultrasonic power on extraction of XAX

2.1.5 響應面分析

2.1.5.1 響應面分析方案及結果

以 A、B、C、D 為自變量，以 XAX 得率為響應值（Y），試驗方案及結果見表2。

對試驗數據進行多項擬合回歸，建立回歸方程：Y=4.56-0.2A-0.064B+0.037C-0.095D+0.21AB-0.25AC-0.15AD+0.13BC-0.052BD+0.06CD-0.25A2-0.14B2-0.27C2-0.06D2，對模型進行方差分析，結果見表3。

由表3可知，該模型P＜0.000 1 為極顯著，說明與實際試驗擬合程度較好。R2=0.920 4 表明模型響應值的變化有92.04%來自因變量的變化，XAX 得率（Y）實際值與預測值有較高的相關性。失擬項P＞0.05，表明失擬項不顯著，因此該模型可以預測響應值XAX 得率的實際情況。各個因素對XAX 得率的影響順序為：木聚糖酶用量＞超聲功率＞超聲時間＞超聲溫度。其中 A、AB、AC、A2、B2、C2對 XAX 得率的影響極其顯著，D、AD、BC 對XAX 得率的影響顯著。

表2 響應面分析方案及結果Table 2 response surface analysis scheme and results

2.1.5.2 交互項解析

圖5a-f 為木聚糖酶用量、超聲時間、超聲溫度及超聲功率之間兩兩交互作用對XAX 得率影響的響應面圖。圖5a 為木聚糖酶用量與超聲時間交互作用對XAX 得率的影響，由圖可知，當木聚糖酶用量一定時，XAX 得率隨著超聲時間的延長表現出先增加后降低的趨勢，當超聲時間一定時，XAX 得率也呈現先升高后降低的趨勢，但變化幅度小于酶用量引起的變化，且等高線呈橢圓形，表明木聚糖酶與超聲時間交互作用對XAX 得率的影響顯著。由圖5b 可知，木聚糖酶用量和超聲溫度的響應曲面陡峭，并且等高線呈橢圓形，表明木聚糖酶用量和超聲溫度交互作用對XAX 得率有極顯著的影響。圖5c 為超聲溫度和超聲時間對XAX 得率的影響，可明顯看出其響應面圖較陡峭，說明超聲時間和超聲溫度的交互作用對XAX 得率有一定的影響。圖5d 為木聚糖酶用量與超聲功率的交互作用對XAX得率的影響，由圖中響應曲面的變化可看出，等高線呈橢圓形，說明木聚糖酶用量大于超聲功率交互作用對XAX 得率的影響顯著，而木聚糖酶用量對XAX 得率的影響大于超聲功率。圖5e 為超聲功率和超聲時間對XAX 得率的影響圖，其中響應面圖較陡峭，說明超聲功率和超聲時間的交互作用對XAX 得率有一定的影響，但并不顯著。圖5f 為超聲溫度和超聲功率的交互作用對XAX 得率的影響，其中響應面圖平緩，且等高線呈圓形，說明超聲功率和超聲溫度的交互作用對XAX 得率影響不顯著。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2 驗證試驗

為驗證模型預測的準確性，對所選的最佳工藝做驗證試驗，試驗重復3 次，結果表明XAX 的組合為木聚糖酶用量39.99 mg、超聲時間90.20 min、超聲溫度56.13 ℃、超聲功率150 W 時XAX 得率為4.83%，與預測結果4.41%基本一致。在此條件下，XAX-1 的得率為11.21%。

2.3 纖維素酶提AX得率

纖維素酶提取的CAX 得率為2.33%，酶提渣通過堿提所得CAX-1 得率為15.98%。

2.4 阿魏酸含量測定

以吸光度為縱坐標（Y），阿魏酸質量濃度為橫坐標（X），得線性回歸方程y=0.213 6x+0.099 4（R2=0.999 5），測得 XAX、CAX、XAX-1、CAX-1 的阿魏酸含量分別（5.34±0.27）、（3.58±0.18）、（3.39±0.16）、（2.57±0.16）μg/mg。由圖可知酶提 AX 中 FA 含量高于渣提物中FA 含量，可能是由于堿法制備AX 過程中伴隨有脫酯化作用，使得單體FA 含量下降。

2.5 體外抗氧化性分析

2.5.1 AX 對·OH 清除率的影響

由圖7可知，4 種 AX 對·OH 清除率隨其濃度的增加，呈先降低后上升的趨勢，當濃度為2 mg/mL時，CAX-1 對·OH 的清除率清除明顯小于XAX、XAX-1、CAX（P＜0.01），XAX 對·OH 的清除率清除小于 CAX（P＜0.05），而 XAX、XAX-1 的清除率不顯著；其對·OH 的清除率清除能力的強弱為CAX＞XAX＞XAX-1＞CAX-1，說明酶提 AX 的·OH 清除率優于堿提殘渣所得AX。這可能是酶提所得的阿魏酸含量較高，其上的酚羥基可以提供氫原子結合·OH自由基，此外，酶提組分的取代都較低，木糖的C(O)-2和C(O)-3 位上的羥基較多，可以結合·OH 自由基，提高了·OH 自由基的清除率[24-25]。

圖5 兩因素交互影響黑小麥AX 得率的響應面圖Figure 5 The response surface plot showing the effect of every two factors interaction on the yield of AX

圖6 AX 中阿魏酸含量Figure 6 The content of Ferulic acid in AX

2.5.2 AX 對DPPH 自由基清除率的影響

由圖8所示，各AX 對DPPH 自由基清除效果與濃度成量效關系。在AX 濃度0～0.4 mg/mL 之間，隨其濃度的增加，對DPPH 的自由基清除率顯著增加，當 AX 濃度大于 0.4～mg/mL 時，CAX、XAX-1、CAX-1 對DPPH 清除率緩慢，而XAX 濃度大于0.8 mg/mL 時，其對DPPH 清除率緩慢，并且當濃度為 0.4 mg/mL 時，XAX、CAX 對 DPPH 自由基清除率沒明顯的區別，而 XAX-1、CAX-1 對 DPPH 自由基的清除率顯著高于XAX、CAX（P＜0.01）；其對DPPH 的清除率強弱為 XAX＞CAX＞XAX-1＞CAX-1，說明酶提AX 的DPPH 自由基清除率優于堿提殘渣中的 AX。當濃度為 1.2 mg/mL 時 XAX、CAX、XAX-1、CAX-1 的清除率分別為97.71%、90.46%、88.09%、82.17%，說明各AX 對DPPH 自由基有強的清除能力。這可能是阿魏酸中含有酚羥基，對DPPH 自由基提供了H+，形成了DPPH-H，使得DPPH 自由基降低[26]。

圖7 AX 對羥自由基清除率的影響Figure 7 Scavenging effects of AX on hydroxyl radicals

圖8 AX 對DPPH 自由基清除率的影響Figure 8 Scavenging effects of AX on DPPH radicals

2.5.3 AX 對O2-·自由基清除率的影響

由圖9可知，這4 種AX 對O2-·的清除率與其濃度不呈量效關系，并且對O2-·清除效果較弱。XAX、CAX、XAX-1、CAX-1 對 O2-·的清除大小為XAX-1＞XAX＞CAX-1＞CAX，說明堿提殘渣所得 AX的O2-·的清除率大于酶提AX。可能是堿提的AX 相對于酶提的AX，分子量較大，取代度高，其上所含較多的單取代或雙取代木糖能夠通過空間位阻阻礙分子間交聯物的形成，從而使AX 在反應體系中更易分散，充分參加氧化還原反應，使得O2-·自由基的清除率更高[27]。

2.5.4 AX 的還原力測定

由圖10知，XAX、CAX、XAX-1、CAX-1 的還原力隨著樣品濃度的增加，沒有明顯的變化。可見樣品濃度為0.1～1.2 mg/mL 時，各組分的還原力與其濃度不呈量效關系，相對于Vc，各組分的還原力較差。

圖9 AX 對超氧陰離子自由基清除率的影響Figure 9 The scavenging effect of AX on superoxide radicals

圖10 AX 的還原力Figure 10 Reductive ability of AX

2.5.5 AX 對鐵離子螯合作用的影響

從圖11中可明顯看出，4 種AX 對鐵離子螯合率隨其濃度的增加呈量效關系，其對鐵離子螯合率的強弱為 CAX-1＞XAX-1＞CAX＞XAX。濃度在0～1 mg/mL 之間時，AX 對鐵離子螯合率隨其濃度的增加呈明顯上升趨勢，之后隨濃度的增加，其對鐵離子的螯合率影響減小；當濃度為1 mg/mL 時，XAX 對鐵離子螯合率明顯低于 CAX、XAX-1、CAX-1（P＜0.01），而 CAX、XAX-1、CAX-1 對鐵離子螯合率不明顯；當濃度為2 mg/mL 時，XAX、CAX、XAX-1、CAX-1 對鐵離子的螯合率分別為28.27%、46.26%、52.36%、60.85%，說明這 4 種 AX 對鐵具有較強的螯合作用并且堿提殘渣組分對鐵離子的螯合率大于酶提組分。這可能是因為官能基團-O-與AX 金屬螯合能力有關，而堿提的取代度比酶提的高，分子量大于酶提，所以-O-較多，因此對鐵離子的螯合率更高[28]。

圖11 AX 對鐵離子螯合率的影響Figure 11 The chelating ability of AX to Fe2+

3 討論與結論

阿拉伯木聚糖常用的提取方法有水提、酶提和堿提，此外還有機械輔助提取。不同的提取方法其優缺點不同，并且由于原料不同，提取得率也不同。蘇東民等[29]為了提高小麥麩皮中WEAX 的得率，采用響應面法對其提取工藝進行了優化，得到了1.467 3%的WEAX，本試驗中AX 得率較高，可能是超聲波法和所加酶對原料細胞壁有較強的破壞作用，使得AX 溶出較多。木聚糖酶作為分離AX 關鍵的酶類型，近年來得到了廣泛應用。馬四平等[30]對小麥麩皮進行了不同的處理，研究了不同處理方式對AX 得率的影響，結果發現當木聚糖酶的添加量為0.16%時，AX 的得率達到最大值為3.654 7%，M.Aguedo 等[31]采用除去淀粉的麩皮為原料，使用枯草芽孢桿菌木聚糖酶處理得到AX 得率為4.3%，其結果低于本試驗所得AX，可能是因為所用酶的類型以及所用原料不同所致。張曉娜[14]在小麥麩皮AX的提取及生理活性的研究中，發現超聲波處理麥麩的WEAX 得率是直接水提取的3.3 倍，并且加酶超聲處理對麥麩的破壁效果優于直接超聲處理的效果，加酶超聲處理30 min 時WEAX 的得率是直接超聲處理的15.5 倍，由此可見超聲處理可以提高多糖得率，而超聲輔助酶法提取可能會達到更好的效果。有研究表明[32]AX 具有抗氧化特性，田貝貝等[33]對小麥淀粉加工廢水中AX 的理化性質及抗氧化活性做了研究。結果表明，源自小麥淀粉廢水的AX 具有較強的還原力和DPPH 自由基清除能力，對羥自由基清除作用則相對較弱，Li Y.等[34]用堿性過氧化氫方法從玉米麩皮中提取CAX，然后通過酯化反應將阿魏酸與CAX 進行共價鍵合，生成阿魏酸阿拉伯木聚糖酯（FA-CAX），并測定了其抗氧化活性，發現更高含量的阿魏酸導致更高的抗氧化活性。本試驗采用木聚糖酶提取黑小麥中的AX，并對提取工藝進行了響應面優化設計，與纖維素酶提作對比；之后分別將兩種酶提殘渣用堿再次提取。結果顯示纖維素酶提取CAX 得率為2.33%、堿提殘渣為CAX-1（得率15.98%）；XAX 反應的最佳工藝條件是木聚糖酶39.99 mg、超聲時間90.20 min、超聲溫度56.13 ℃、超聲功率150 W，此時AX 得率為4.83%，堿提殘渣所得產物XAX-1（得率11.21%），表明酶提后剩余殘渣再次提取可提高AX 得率。通過對 XAX、CAX、XAX-1 和 CAX-1 的抗氧化活性進行分析得出這4 種AX 都具有一定的抗氧化性，且抗氧化性不完全與阿魏酸含量呈正相關，可能由多方面因素影響。