虎杖提取物血脂調節作用及其機制研究

趙圣劍,田香霞

(河南中醫藥大學第三附屬醫院，河南 鄭州 450008)

近年來，隨著經濟社會發展，人們生活水平提高及生活習慣改善，高脂血癥的發生率逐年增加，并呈年輕化趨勢，高脂血癥與其他心腦血管風險因素相互作用，易導致動脈粥樣硬化，增加心腦血管發病率和死亡率[1]。西藥雖有很好的降血脂療效，但會引起胃腸道、肝腎損害等毒副作用[1]。中醫認為，血脂異常與肝、脾、腎最為密切，以脾腎虛弱為本，以痰濁、血瘀、氣滯為標；在中醫理論的指導下，近年來，中藥已廣泛應用于高血脂癥的治療，具有療效好、副作用小等優點[2]?；⒄?PolygonumcuspidatumSieb.et Zucc.)是蓼科蓼屬Polgohum L.多年生灌木狀草本植物，以干燥莖和根入藥，味微苦、性寒，歸肝、膽、肺經；現代藥理研究證實，虎杖提取物具有多種藥理作用，包括抗炎、調血脂、抗血栓、抗氧化等[3]?；⒄溶帐菑幕⒄雀o中提取的單體，是白藜蘆醇與葡萄糖結合的產物，具有與白藜蘆醇相似的藥理作用[4]，目前關于虎杖苷的降脂作用研究較少，為了明確虎杖提取物中對調血脂作用的效果及機制，為臨床合理應用提供依據，本文研究虎杖提取物對高血脂癥大鼠的降血脂作用，并探討其可能的機制，現報道如下。

1 材料

1.1 藥物與試劑

虎杖苷(西安藥材公司，產地陜西)；辛伐他汀(杭州默沙東制藥有限公司)；膽固醇、膽酸鈉均購自湖北鴻運隆生物科技有限公司；總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、氧化低密度脂蛋白膽固醇(oxygen low density lipoprotein cholesterol,ox-LDL-C)測定試劑盒均購自上海生工生物工程有限公司；過氧化氫酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、一氧化氮(nitric oxide,NO)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；肉堿軟脂?；D移酶-I(carnitine palmitoyltransferase-I，CPT-Ⅰ)、肉堿軟脂酰基轉移酶-Ⅱ(carnitine palmitoyltransferase-Ⅱ，CPT-Ⅱ)、乙酰CoA羧化酶(acetylcoa carboxylase，ACC)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)定量檢測試劑盒購自上海江萊生物技術有限公司。

1.2 主要儀器

J-25型高速冷凍離心機(美國貝克曼公司)；7100型全自動生化分析儀(日本日立公司)；S-10高速分散器(寧波新芝生物科技有限公司)；CX21FSIC型顯微鏡(奧林巴斯公司)。

1.3 實驗動物

雄性SD大鼠48只，體質量200～250 g，購自河北省實驗動物中心，許可證號SCXK(冀)2003-1-003。適應性喂養1周，喂養環境：溫度25℃±5℃，相對濕度50%，12 h晝夜交替。

2 方法

2.1 動物分組及模型建立

所有大鼠均經適應性喂養1周后，隨機分為空白對照組、模型對照組、陽性對照組、虎杖提取物組，每組各12只，其中空白對照組大鼠繼續喂養普通飼料，其他組大鼠喂養高脂飼料，連續喂養4周后，眼眶取血，3 500 r/min離心15 min，分離得血清，按照試劑盒說明書測定TC和TG，TC和TG升高說明造模成功[5]。從第5周開始陽性對照組大鼠灌胃給予辛伐他汀6 mg/(kg·d)，虎杖提取物組大鼠灌胃給予虎杖苷100 mg/(kg·d)，空白對照組、模型組大鼠灌胃給予蒸餾水，1次/d，連續給藥4周。

2.2 指標測定

2.3.1 血脂水平測定

連續給藥4周后，眼眶取血，室溫靜置30 min后，3 500 r/min離心15 min，分離得血清，按照試劑盒說明書操作，采用全自動生化分析儀測定TG、TC、HDL-C、LDL-C、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)。

2.3.2 脂質過氧化指標測定

連續給藥4周后，眼眶取血，室溫靜置30 min后，3 500 r/min離心15 min，分離得血清，按照試劑盒說明書操作，測定一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)濃度，及過氧化氫酶(CAT)、過氧化物歧化酶(SOD)活性。

2.3.3 脂質代謝酶測定

取大鼠肝臟0.1 g，加10倍的4℃緩沖液冰浴勻漿，制成10%勻漿液，4℃下2 000 r/min離心10 min，分離得上清液，-20℃保存待測。按照試劑盒說明書操作，測定CPT-I、CPTII、ACC和FAS水平。

2.3.4 組織形態學及脂聯素受體2(adipo R2)免疫組化觀察

連續給藥4周后，處死大鼠。取大鼠部分肝臟，以4%多聚甲醛液固定，經梯度乙醇脫水，每次30 min，二甲苯透明、石蠟包埋，切成5 μm薄片，45℃烘干，二甲苯脫去石蠟，梯度乙醇(100%、95%、80%、75%)浸泡，每次5 min，蒸餾水浸泡3 min，HE染色10 min，無水乙醇脫水，二甲苯透明，滴加中性樹脂，蓋上蓋玻片封片，光鏡下觀察，選取不同的視野，觀察并拍照。

另取剩余大鼠肝臟制作石蠟切片，石蠟切片置于67℃烘箱中，烘片2 h，脫蠟至水，用pH7.4的PBS沖洗3次，每次3 min。取一定量pH6.0的檸檬酸鹽緩沖液，加入微波盒中，微波加熱至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，中檔微波處理10 min，取出微波盒流水自然泠卻，從緩沖液中取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用PBS沖洗2次,每次3 min。 每張切片加1滴3%過氧化氫溶液，室溫下孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3次,每次3 min。最后在顯微鏡下讀片，拍照。

2.3.5 adipo R2 mRNA與PPARα mRNA測定

取肝臟組織0.6 g，采用總RNA提取試劑盒提取肝臟組織總RNA，NAase 37℃消化5 min，反轉錄試劑盒進行總RNA的反轉錄，獲取得cDNA，熒光定量PCR檢測RNA水平的表達，本研究用到的PPARα mRNA及adipo R2 mRNA的引物序列見表1。內參為β-actin。定量PCR檢測adipo R2 mRNA及PPARα mRNA的反應條件在94℃ 1 min，95℃ 10 s，55℃ 10 s，72℃ 10 s(40個循環)下進行。adipo R2、PPARα序列及引物均有上海江萊生物技術有限公司購買合成。

表1 adipo R2及PPARα引物信息

2.4 統計學分析

3 結果

3.1 血脂水平

與空白對照比較，模型對照組的TC、TG、LDL-C、ox-LDL表達水平顯著升高(P<0.05)，HDL-C表達水平顯著降低(P<0.05)。與模型對照組比較，虎杖苷組和陽性對照組TC、TG、LDL-C、ox-LDL表達水平顯著降低(P<0.05)，HDL-C表達水平顯著升高(P<0.05)，虎杖苷組與陽性對照組無顯著性差異(P>0.05)。見表2。

3.2 組織學形態

正常對照組大鼠肝臟被膜光滑，無病變跡象，呈深紅色，質韌有彈性。模型對照組大鼠肝臟體積較大，表面暗淡，邊緣較圓鈍，呈彌漫性淡粉紅色，質軟。陽性組和虎杖苷組無明顯差異。光鏡檢查可知，正常對照組大鼠肝細胞呈規則六邊形，索狀分布，胞質均勻，胞核清晰細胞間分界清楚，無病變，無脂肪滴和炎性浸潤。模型對照組大鼠肝臟輕微病變，部分細胞呈不規則，肝組織中存在較多脂肪滴。陽性對照組和虎杖苷組大鼠的肝臟脂肪變性程度均輕于模型組，虎杖苷組病變最輕。見圖1。

組別TC(mmol/L)TG(mmol/L)LDL-C(mmol/L)HDL-C(mmol/L)ox-LDL(ng/mL)空白對照組1.744±0.390△0.538±0.1000.554±0.0911.403±0.14418.524±6.543模型對照組4.510±0.590△1.940±0.086△1.432±0.113△0.886±0.056△32.371±9.115△陽性對照組2.492±0.321*1.314±0.076*0.803±0.116*1.329±0.167*22.146±6.252*虎杖苷組2.256±0.099*1.253±0.078*0.874±0.046*1.298±0.110*19.613±7.214*

注：與空白對照組相比，△P<0.05；與模型組相比，*P<0.05

圖1 各組大鼠肝臟組織學形態圖片(×400)

3.3 脂質過氧化酶水平對比

與空白對照組相比，模型對照組大鼠血清中CAT、SOD的活性明顯降低(P<0.05)，NO水平顯著降低(P<0.05)，MDA的含量顯著升高(P<0.05)。與模型對照組相比，陽性對照組和虎杖苷組大鼠血清中CAT、SOD活性顯著升高(P<0.05)，NO水平顯著升高(P<0.05)，MDA活性顯著降低(P<0.05)，且虎杖苷組較陽性對照組改善明顯(P<0.05)。見表3。

表3 各組脂質過氧化指標結果比較

注：與空白對照組相比，△P<0.05；與模型組相比，*P<0.05；與陽性對照組相比，☆P<0.05

3.4 肝臟脂質代謝酶水平對比

與空白對照組相比，模型對照組大鼠血清中CPI-I、CPI-II、FAS和ACC表達水平顯著升高(P<0.05)，HMGR表達水平顯著降低(P<0.05)。與模型對照組相比，陽性對照組和虎杖苷組大鼠血清中CPI-I、CPI-II、FAS和ACC表達均顯著降低(P<0.05)，HMGR表達水平顯著升高(P<0.05)，且虎杖苷組較陽性對照組改善明顯(P<0.05)。見表4。

3.5 adipo R2和PPARα mRNA水平對比及adipo R2免疫組化信息

與模型對照組相比，陽性對照組和虎杖苷組大鼠肝組織中adipo R2 mRNA水平顯著提升(P>0.05)，與陽性對照組相比，虎杖苷組大鼠肝組織中PPARαmRNA表達水平均顯著升高(P<0.05)，見表5。對比空白對照組、陽性對照組以及虎杖苷組adipo R2免疫組化結果，adipo R2均有廣泛表達。

組別CPI-I(pg/mL)CPI-II(pg/mL)FAS(pg/mL)ACC(U/mL)HMGR(pg/mL)空白對照組96.34±1.7893.10±1.9865.99±2.2790.01±2.1975.31±3.16模型對照組145.71±1.23△140.00±2.29△87.63±3.17△145.20±1.51△97.26±5.25△陽性對照組128.59±1.60*119.06±1.54*76.36±2.45*128.69±1.31*87.65±3.54*虎杖提取無組105.43±1.23*☆102.32±1.25*☆69.35±1.52*☆105.38±1.47*☆80.26±2.37*☆

注：與空白對照組相比，△P<0.05；與模型組相比，*P<0.05；與陽性對照組相比，☆P<0.05

圖2 三組adipo R2免疫組化圖片(×400)

表5 各組adipo R2 mRNA與PPARα mRNA水平結果比較

注：與空白對照組相比，△P<0.05；與模型組相比，*P<0.05；與陽性對照組相比，☆P<0.05

4 討論

脂類是人體結構和營養的重要物質，其在正常機體內的吸收和代謝維持著平衡狀態。但隨著人們生活水平提高、生活習慣改變，人們脂類物質的攝入增加，打破了脂質吸收和代謝平衡，導致高血脂癥的發病人數逐漸增多。統計數據顯示，我國成人高血脂癥的患病率為20%，患病人數高達1.6億人，不僅增加動脈粥樣硬化的發生風險，同時也增加了高血壓、糖尿病、冠心病等發病風險，增加心腦血管疾病的發病率和死亡率[6]。西藥降血脂效果明顯，但毒副作用較大，限制其長期的臨床應用。因此，發掘祖國傳統醫藥資源，尋找安全、療效顯著的調脂中藥具有重要意義。

雖中醫學中無高血脂概念，但可用中醫血、津、液概括，《靈樞·血絡論》中“其血黑以濁”與高血脂癥、高黏血癥概念極為相近，形象地說明了氣血津液代謝失調，破壞“陰平陽秘”動態平衡，以致痰瘀膠結于血脈中的狀況[7]。歷代醫家認為，嗜食肥甘厚味為標，脾腎運化失職為本，二者致氣機阻滯，痰瘀內聚，膏脂不歸正化，血脂異常多與肝、脾、腎三臟最為密切，以脾腎虧虛、肝失調達為本，以痰濁、血瘀、氣滯為標，因此，對該病的治療主張以調節肝腎虧虛為主[8-9]?；⒄任段⒖?、性寒，歸肝、膽、肺經，廣泛應用于心血管疾病的治療，如虎杖降脂顆粒、血脂寧等方中均含有虎杖，在降血脂方面取得了一定療效，但關于其主要降脂活性物質及機制的研究較少，虎杖苷是虎杖的主要成分，是白藜蘆醇與葡萄糖結合的產物，又稱為白藜蘆醇苷，而白藜蘆醇抗脂質過氧化、降血脂、保護血管等藥理作用已被證實。

本文通過喂養高脂飼料建立大鼠高脂血癥模型，灌胃給予虎杖苷治療，結果顯示：虎杖苷可以顯著降低高脂癥大鼠血清中的TC、TG、LDL-C和ox-LDL水平，提高HDL-C水平，提高adipo R2與PPARα表達水平，減小LDL-C/HDL-C比值。血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C水平是血脂變化的重要監測指標，TC和TG過高時會導致高膽固醇血癥，LDL-C和ox-LDL是導致動脈粥樣硬化性脂蛋白，其水平升高會導致心腦血管疾病；HDL-C主要功能是將肝外組織中過多的膽固醇轉運到肝臟代謝，減少組織中膽固醇的聚集，可競爭性抑制LDL與內皮細胞受體結合，具有防止動脈粥樣硬化、降低冠心病病死率的作用[10-11]，adipo R2為脂聯素的受體，脂聯素是脂肪細胞分泌的一種內源性生物活性多肽或蛋白質，能預示II型糖尿病和冠心病等的發展。組織學觀察發現，虎杖苷組大鼠肝臟脂肪變性程度較模型對照組均顯著改善，同時免疫組化結果顯示虎杖苷組adipo R2表達程度與空白對照相近，較陽性對照組有很大提高，上述結果說明虎杖苷可以有效降低高脂血癥大鼠血脂水平，改善肝臟脂肪變性程度。

本文在研究虎杖苷調節血脂機制過程中發現，虎杖苷可以有效提高高脂血癥大鼠血清CAT、MDA和NO水平，下調SOD水平。CAT、MDA、SOD和NO是機體氧化應激的重要因子，氧化應激能夠引起細胞膜脂質過氧化，產生丙二醇和β-羥化壬烯，水解B-100，抑制TG向LDL-C轉變，抑制肝臟向外輸送脂肪酸，造成脂肪堆積[12-13]。CAT主要是催化體內的過氧化氫，使細胞免受過氧化氫的損傷，其水平降低提示機體清除過氧化氫能力降低，增加了細胞被過氧化氫損傷的風險；MDA是脂質代謝的一個最終產物，產生的自由基能夠嚴重的破壞肝細胞膜的結構，導致肝細胞發生腫脹、壞死。SOD能夠清除超氧陰離子自由基，減輕和阻斷脂質過氧化，對肝細胞有保護作用[14]。上述結果說明虎杖苷可以有效糾正高脂血癥大鼠的氧化應激狀態，減少脂質過氧化，防止脂肪堆積。

CPT-I、CPI-II是脂肪代謝的限速酶，CPI-I的活性受丙二酰輔酶A調控，是脂肪酸吸收的限速因素[15]。研究表明CPT-I與機體脂肪沉積有一定關系，其表達水平升高有助于增加脂肪酸分解并降低體脂肪的含量[16]。FAS和ACC是肝臟組織脂肪酸合成過程中重要酶，ACC催化乙酰輔酶A羧化成丙二醛輔酶A，FAS催化乙酰輔酶A及丙二醛輔酶A合成長鏈脂肪酸[17]。本研究發現，虎杖苷可以上調高脂血癥大鼠肝臟CPT-I和CPI-II的表達水平，下調FAS和ACC酶水平，說明虎杖苷一方面減少脂肪酸合成，另一方面能促進脂肪氧化分解，從而減少脂肪積累。HMGR是體內催化膽固醇合成的關鍵酶，通過調節HMGR的活性，可以調節血脂水平[18]。在本次試驗中，與對照組相比，各組大鼠肝臟HMGR的表達水平均有下降。與高脂對照組相比，各個劑量組大鼠肝臟HMGR的表達水平均顯著降低，說明丹參素對高脂血癥大鼠肝臟HMGR的表達有進一步地抑制作用，從而減少膽固醇的合成。adipo R2與PPARα都為體內調節脂聯素代謝水平的重要受體，且均與脂聯素水平為正相關，結合研究結果虎杖苷可以在基因層面調節受體表達，從而調節降低血脂水平。

綜上，虎杖苷可以有效降低高脂血癥大鼠的血脂水平，改善肝臟脂肪病變，其機制可能與減少脂肪酸和膽固醇合成，糾正高脂血癥大鼠氧化應激狀態，從而減少脂質過氧化，防止脂肪堆積。大鼠血漿膽固醇的主要載體為HDL，約占血漿脂蛋白的80%，而人血漿膽固醇的主要載體是LDL，約占血漿脂蛋白的60%，但大鼠具有成本低、易飼養、模型穩定等優點，且大鼠在膽固醇合成、代謝及對膳食膽固醇負荷的反應等方面更接近人類[19]。因此，本文選用大鼠建立高脂血癥模型，實驗結果具有一定的科學性。