健脾解毒中藥對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖及PI3K、AKT表達(dá)的影響

張斌，徐春江，查芳芳，丁慎華，朱薇珊，錢雪梅

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院，上海 201700)

原發(fā)性肝癌(primary liver cancer，PLC)是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)、最致命的腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率分別居所有腫瘤的第 7 位和第 4 位[1]，其5 年總生存率仍徘徊在3～5%之間，也是我國(guó)發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一[2-3]。肝癌患者早期往往癥狀缺乏，許多患者在體檢中無(wú)意發(fā)現(xiàn)，而一旦發(fā)現(xiàn)，常常是中晚期，甚至出現(xiàn)多臟器的轉(zhuǎn)移，治療難度很大，也缺乏特效的藥物治療。目前其發(fā)病機(jī)制還不十分清楚[4]，多認(rèn)為與表觀遺傳改變、染色體改變、等位基因丟失、基因突變以及分子細(xì)胞通路的改變等多因素密切相關(guān)，因而積極探索肝癌發(fā)病機(jī)制，并研究早期診斷、預(yù)防和治療方法，是肝癌防治的關(guān)鍵。健脾解毒方由黨參、生黃芪及生白術(shù)等組成，具有益氣健脾、理氣解毒等多種作用，在臨床運(yùn)用中顯示了較好的抗腫瘤作用，尤其對(duì)胃腸道腫瘤及肝癌等有較好的療效，為探索其機(jī)制，我們前期運(yùn)用健脾解毒中藥對(duì)二甲基亞硝胺誘導(dǎo)大鼠肝癌模型進(jìn)行了干預(yù)，發(fā)現(xiàn)中藥有延緩肝癌發(fā)病的作用，其機(jī)制部分與其下調(diào)大鼠肝組織PI3K/AKT信號(hào)通路的表達(dá)有關(guān)[5-6]。為進(jìn)一步探討其機(jī)制，本研究采用健脾解毒中藥藥物血清對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，以探索健脾解毒中藥對(duì)肝癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并探索PI3K/AKT信號(hào)通路與肝癌發(fā)病的相關(guān)性，為中藥抗肝癌作用提供依據(jù)。

1 材料及儀器

1.1 細(xì)胞株

中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)為本研究提供了肝癌細(xì)胞HepG2，采用RPMI 1640進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，其培養(yǎng)液中含有100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素及10%胎牛血清，其中培養(yǎng)箱條件設(shè)置為37℃、5%CO2，每隔3～4 d進(jìn)行傳代，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞用于科研。

1.2 實(shí)驗(yàn)大鼠

采用雄性SD大鼠，共20只，平均體質(zhì)量(100±10)g，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，該動(dòng)物房為SPF級(jí)別，大鼠采取普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水，用于制備藥物血清。

1.3 藥物

中藥方劑由生黃芪、八月札、薏苡仁、野葡萄藤、豬苓、黨參、生白術(shù)及紅藤組成，藥物比例10∶10∶10∶8∶10∶5∶5∶8，水煎濃縮成每毫升含生藥1.30 g，保存于4℃冰箱中。PI3K抑制劑LY294002(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)。

1.4 主要試劑

胎牛血清、0.25%胰酶-EDTA 、RPMI 1640培養(yǎng)液及小牛血清等購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；Sigma公司提供了二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)及Trizol RNA試劑，上海碧云天生物技術(shù)有限公司為本研究提供了鼠抗人SEPP1單克隆抗體及兔抗人GAPDH單克隆抗體。

1.5 儀器設(shè)備

96孔培養(yǎng)板購(gòu)自Nunc公司；電子天平為MettlerToledo公司產(chǎn)品。CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自Binder公司；多功能倒置相差顯微鏡的型號(hào)為(Olympus CK40)，ELX-800全自動(dòng)酶標(biāo)儀。

2 方法

2.1 中藥藥物血清制備

20只大鼠隨機(jī)分為兩組，其中A組：健脾解毒方藥物血清組，健脾解毒方按成人體重用藥劑量將生藥換算為50 g/kg的濃度，連續(xù)5 d給大鼠灌胃；B組為空白對(duì)照組，采取連續(xù)5 d給大鼠灌服等體積的生理鹽水。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，末次給藥后2 h,腹主動(dòng)脈采血，離心，分離血清，56℃滅活，使用0.22 μm微孔過(guò)濾除菌分裝，上述血清保存條件為-80℃冰箱。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

采用10%胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)，培養(yǎng)箱設(shè)置為37℃、5%CO2飽和濕度，每2～3 d進(jìn)行傳代，換液48 h后收集細(xì)胞用于研究。實(shí)驗(yàn)分組如下：①空白對(duì)照組；②空白血清組：加入體積分?jǐn)?shù)為10%的空白血清；③中藥組(L)：加入體積分?jǐn)?shù)為10%的中藥藥物血清；④中藥組(M)：加入體積分?jǐn)?shù)為15%的中藥藥物血清；⑤中藥組(H):加入體積分?jǐn)?shù)為20%的中藥;⑥LY294002組:加入終濃度50 μmol/L的LY294002。

2.3 細(xì)胞增殖測(cè)定

采取MTT法進(jìn)行測(cè)定，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞濃度為1×104，每孔約200 μL。培養(yǎng)24 h后，廢棄培養(yǎng)液，重新加入溫育液，于培養(yǎng)24 h及48 h時(shí)每孔加入20 μL的MTT 液(5 mg/mL)，培養(yǎng)4 h后廢棄上清，加入DMSO，采用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定，取490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度(OD值)。計(jì)算抑制率(%)=(1-用藥組平均OD值/對(duì)照組平均OD值)×100%。

2.4 細(xì)胞凋亡率

收集培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min后，廢棄上清液，采用PBS進(jìn)行清洗2次，將緩沖液、AnnexinⅤ-FITC 抗體及PI染液依次加入，在室溫下避光放置15 min，送流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 蛋白表達(dá)檢測(cè)

采取Western blot法進(jìn)行檢測(cè)，具體參考文獻(xiàn)[5]方法進(jìn)行。重復(fù)檢測(cè)3次。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(means±sd)進(jìn)行表示，其中組間比較采用t檢驗(yàn)方法，方差分析采用單因素法進(jìn)行比較，結(jié)果按照P<0.05為統(tǒng)計(jì)有差異。

3 結(jié)果

3.1 健脾解毒中藥對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響

表1對(duì)各組細(xì)胞增殖進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)LY294002組及各中藥劑量組均有顯著抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用，尤其是LY294002及高劑量中藥組的抑制作用最大(P<0.01)，其次為中低劑量中藥組。表明健脾解毒中藥藥物血清對(duì)肝癌細(xì)胞增殖有一定的抑制作用，尤其是中高劑量組抑制作用更加明顯。

表1 各組細(xì)胞增殖比較

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與LY294002組比較，△△P<0.01

3.2 健脾解毒中藥對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響

采用流式細(xì)胞儀比較了各組細(xì)胞的凋亡率，發(fā)現(xiàn)LY294002組及各劑量中藥組均有顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡作用，尤其是LY294002組及中高劑量中藥組作用最強(qiáng)(P<0.01)，表明健脾解毒中藥藥物血清對(duì)肝癌細(xì)胞有促進(jìn)凋亡作用(見(jiàn)表2及圖1)。

表2 各組肝癌細(xì)胞凋亡情況比較

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與LY294002組比較，△△P<0.01

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01圖1 各組細(xì)胞凋亡率比較

3.3 肝癌細(xì)胞AKT、PI3K蛋白表達(dá)

采用Western blot對(duì)各組肝癌細(xì)胞的AKT及PI3K蛋白表達(dá)情況進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)LY294002組及中高劑量中藥組有顯著下調(diào)AKT及PI3K蛋白表達(dá)的作用，而低劑量中藥組僅對(duì)PI3K有輕度下調(diào)，對(duì)AKT表達(dá)影響不明顯(見(jiàn)表3及圖2)。上述研究表明健脾解毒中藥抑制肝癌細(xì)胞增殖可能與下調(diào)AKT及PI3K蛋白表達(dá)有關(guān)。

表3 各組細(xì)胞蛋白表達(dá)比較

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01，；與LY294002組比較，△P<0.05,△△P<0.01

注：A.空白對(duì)照組；B.空白血清組；C.中藥組(L);D.中藥組(M);E.中藥組(H);F.LY294002組圖2 各組細(xì)胞蛋白表達(dá)情況

4 討論

肝癌的發(fā)生與等位基因丟失、染色體改變、基因突變、表觀遺傳改變以及分子細(xì)胞通路等多因素改變密切相關(guān)，其中針對(duì)分子細(xì)胞通路的研究受到很多學(xué)者的高度重視。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin、RAS和PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通道與肝癌發(fā)病關(guān)系密切[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，在PI3K/AKT通道中，PI3K是一種脂類激酶，可以催化磷脂酰肌醇D3磷酸化，與細(xì)胞異常增殖有關(guān)。AKT是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，參與細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)、膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、核糖體合成及蛋白質(zhì)降解等過(guò)程，是激活PI3K下游最主要的信號(hào)分子[9]，PI3K/AKT通路調(diào)控細(xì)胞代謝、蛋白合成、細(xì)胞增殖與凋亡等重要生理過(guò)程[10-13]，共同參與細(xì)胞增殖和存活的調(diào)節(jié)，其異常表達(dá)與多種腫瘤發(fā)病密切有關(guān)，也與肝癌發(fā)病密切相關(guān)[14-15]。因而該通道受到很多學(xué)者的重視，已經(jīng)針對(duì)該通道開(kāi)發(fā)了PI3K抑制劑，AKT抑制劑和mTOR抑制劑等抗腫瘤藥物，大大改善了患者的病情發(fā)展，有很好的臨床運(yùn)用前景。

中醫(yī)文獻(xiàn)中有“臌脹”“肝積”“癮瘕”“積聚”“黃疸”“脅痛”等名詞的記載都與肝癌相關(guān)，中醫(yī)對(duì)肝癌病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)，包括內(nèi)因及外因，其中內(nèi)因主要是勞倦內(nèi)傷、脾運(yùn)失健、情志失調(diào)、志郁不達(dá)及肝失疏泄；外因歸為濕熱毒邪、內(nèi)侵肝膽、嗜好煙酒、化濕生熱及久蘊(yùn)生毒。在病機(jī)方面認(rèn)為肝脾腎三臟同病是發(fā)病的關(guān)鍵，逐漸出現(xiàn)肝郁脾虛血瘀，造成濕、熱、氣、血、毒聚結(jié)成塊，可形成肝積。健脾解毒方為上海中醫(yī)藥大學(xué)范忠澤教授的抗腫瘤經(jīng)驗(yàn)方，經(jīng)過(guò)多年臨床研究，認(rèn)為肝癌發(fā)生多由飲食不節(jié)(潔)、情志不遂、勞倦等多種因素引起邪毒內(nèi)生而引起，病機(jī)特點(diǎn)是本虛標(biāo)實(shí)，本虛以脾氣虛為主，標(biāo)實(shí)為邪毒(熱、濕熱毒邪)郁肝，治以益氣健脾，理氣解毒。范教授據(jù)此選擇了生黃芪、八月札、薏苡仁、野葡萄藤、豬苓、黨參、生白術(shù)、紅藤等進(jìn)行組方，通過(guò)臨床運(yùn)用，發(fā)現(xiàn)對(duì)包括肝癌、胃腸道腫瘤及肺癌等均有較好效果，目前此方已經(jīng)獲得國(guó)家專利。為了探索該方在肝癌防治中的作用機(jī)制，我們前期研究發(fā)現(xiàn)，該方可以較好的延緩DNE誘導(dǎo)大鼠肝癌的發(fā)生和發(fā)展，其機(jī)制部分與中藥調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路的表達(dá)有關(guān)[5-6]。為進(jìn)一步探索其機(jī)制，本課題在前期研究工作基礎(chǔ)上，選擇人肝癌HepG2細(xì)胞開(kāi)展研究，發(fā)現(xiàn)該方有下調(diào)PI3K/AKT表達(dá)的作用。同時(shí)選擇PI3K抑制劑LY294002作為對(duì)照,發(fā)現(xiàn)中藥有類似LY294002作用,有抑制肝癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，有進(jìn)一步進(jìn)行臨床推廣和研究的價(jià)值。