復(fù)方芩蘭口服液兒童用藥最佳有效劑量的研究

孫靜，郭姍姍，韓冰，葛一蒙，趙榮華，時(shí)宇靜，包蕾，毛鑫，崔曉蘭*

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700；2.黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司，黑龍江 哈爾濱 158400)

兒童作為一個(gè)特殊的群體，身體器官和生理功能尚未發(fā)育成熟，因此在眾多的藥品不良反應(yīng)和藥害事件中，兒童往往會(huì)成為受害群體之一。究其原因，除了兒童的抵抗力較弱外，根本原因還在于藥品缺乏兒童型及使用不規(guī)范所致。初步統(tǒng)計(jì)表明，我國約40%～60%的西藥及中成藥說明書沒有明確的兒童使用劑量。“小兒減半、兒童酌減”之類的含糊字眼給臨床治療造成極大困擾，因此，明確成人用藥改兒童用藥的用法用量，為兒童臨床應(yīng)用提供參考，意義重大。

復(fù)方芩蘭口服液為已上市中成藥，功能主治為辛涼解表，清熱解毒，臨床用于外感風(fēng)熱引起的發(fā)熱、咳嗽、咽痛。現(xiàn)說明書用法用量為：成人每次10～20 mL，每日3次，兒童酌減或遵醫(yī)囑。本次研究目的是探討復(fù)方芩蘭口服液兒童用藥的最佳有效劑量范圍，為兒童臨床應(yīng)用提供參考。研究中，劑量設(shè)計(jì)采用已知成人用量換算兒童用量的計(jì)算方法(包括體質(zhì)量換算、體表面積換算，比例換算，年齡換算法)設(shè)定1～12歲兒童的用藥范圍、采用與功能主治相關(guān)的主要藥效學(xué)幼齡動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?duì)已設(shè)定劑量范圍的有效性進(jìn)行評(píng)價(jià)；最終初步確定兒童用量的最佳劑量范圍。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

ICR小鼠(SPF/VAF級(jí))，體質(zhì)量14.00±1.00 g，3周齡，雌雄各半，由北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證SCXK(京)2012-0001。

1.2 病毒株

流感病毒FM1株，購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC)，本實(shí)驗(yàn)室傳代，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 受試藥物

復(fù)方芩蘭口服液，由黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司提供。批號(hào)：B14160601，生產(chǎn)日期：2016.6.8，有效期：2018.6。用法用量：口服，60 kg成人用量每次10～20 mL，每日3次，小兒酌減或遵醫(yī)囑；性狀：棕黃色至深棕色的澄清液體。儲(chǔ)存條件：密封，置陰涼處(不超過20℃)。

1.4 陽性對(duì)照藥

小兒感冒口服液(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，批號(hào)14262324)，利巴韋林顆粒(四川百利藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)150144)，阿司匹林腸溶片(Bayer Health Care Manufacturing S.r.l，批號(hào)BJ26800)，復(fù)方甘草片(華潤雙鶴藥業(yè)有限公司，批號(hào)15012101)。

1.5 試劑

營養(yǎng)肉湯(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)20140320)，冰醋酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20141121)，乙醚(北京化工廠，批號(hào)20120131)，氨水(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20120918)，脂多糖(SIGMA公司，批號(hào)046M4045V)。

1.6 儀器

A2型生物安全柜(Thermo，型號(hào)：MSC1.8)，低溫高速離心機(jī)(Eppendorf，型號(hào)：5810R)，電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：YP1002)，電子分析天平(OhausCorp.Brock. WJ.USA，型號(hào)：AR1140)，多功能酶標(biāo)儀(PerkinElmer，型號(hào)Enspire)，電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司，型號(hào)：BSA3202S-CW)，超聲霧化器(江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司，型號(hào)：402A)，IVC小鼠飼養(yǎng)籠(蘇州教學(xué)籠具廠)。

2 方法

2.1 劑量設(shè)置

根據(jù)品種現(xiàn)在成人用量，采用4種換算方法[1]均得到1～12歲小兒用量在0.6～1.1 mL·(kg·d)-1之間，試驗(yàn)中擴(kuò)展劑量范圍，選擇0.2、0.5、0.7、0.9、1.1、1.4 mL·(kg·d)-16個(gè)劑量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。換算成小鼠用量分別為2.2、5.5、7.7、9.9、12.1、15.4 mL·(kg·d)-1；家兔用量分別為0.6、1.5、2.1、2.7、3.3、4.2 mL·(kg·d)-1。

2.2 抗病毒作用

2.2.1 對(duì)流感病毒(FM1株)感染幼齡小鼠致肺炎模型的治療作用

取ICR小鼠100只，體質(zhì)量(14.00±1.00)g，3周齡，雌雄各半，按體質(zhì)量等級(jí)隨機(jī)分為10組，分別為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、利巴韋林對(duì)照組、小兒感冒口服液對(duì)照組、復(fù)方芩蘭口服液2.2、5.5、7.7、9.9、12.1、15.4 mL·(kg·d)-16個(gè)劑量組，每組10只。除正常對(duì)照組外，將小鼠用乙醚輕度麻醉，以15個(gè)LD50流感病毒液(FM1株)滴鼻感染，每只35 μL。感染當(dāng)天各給藥組灌胃給藥，0.02 mL·g-1，每日1次，連續(xù)4 d，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組在同等情況下給蒸餾水。于第5日稱體質(zhì)量后，小鼠脫頸椎處死，然后解剖取肺組織，稱重，計(jì)算肺指數(shù)及肺指數(shù)抑制率。結(jié)果采用組間比較t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理[2]。

2.2.2 對(duì)流感病毒(FM1株)感染幼齡小鼠致肺炎模型的死亡保護(hù)作用

取ICR小鼠180只，體質(zhì)量(14.00±1.00)g，3周齡，雌雄各半，隨機(jī)分為9組，每組20只。各組小鼠用乙醚輕度麻醉，以2個(gè)LD50流感病毒液(FM1株)滴鼻感染，每只35 μL。感染當(dāng)天各給藥組灌胃給藥，0.02 mL·g-1，每日1次，連續(xù)4 d，模型對(duì)照組在同等情況下給蒸餾水。觀察感染后2周內(nèi)動(dòng)物的死亡情況，計(jì)算死亡率、死亡保護(hù)率、平均存活天數(shù)和生命延長率。結(jié)果采用組間比較卡方檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理[3]。

死亡率=( 死亡數(shù)/動(dòng)物總數(shù) )×100%

2.3 抗炎作用:對(duì)冰醋酸致幼齡小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響

取ICR小鼠100只，體質(zhì)量(14.00±1.00)g，3周齡，雌雄各半，按體質(zhì)量等級(jí)隨機(jī)分為10組，每組10只。各給藥組灌胃給藥，0.02 mL·g-1，每日1次，連續(xù)3 d，正常對(duì)照組及模型對(duì)照組在同等情況下給蒸餾水。最后1次灌胃給藥1 h后，每只小鼠腹腔注射1%冰醋酸溶液0.2 mL/只，并尾靜脈注射0.5%伊文思蘭溶液0.2 mL/只，20 min后脫頸處死小鼠，用生理鹽水沖洗腹腔，每只5 mL并收集腹腔液，在1 000 r·min-1離心5 min，取上清液，用多功能酶標(biāo)儀在590 nm處測(cè)定吸光度，以t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，比較模型對(duì)照組與給藥組是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[4]。

2.4 止痛作用：對(duì)冰醋酸致幼齡小鼠疼痛模型的影響(扭體實(shí)驗(yàn))

取ICR小鼠100只，體質(zhì)量(14.00±1.00)g，3周齡，雌雄各半，隨機(jī)分為9組，每組10只。各給藥組灌胃給藥，0.02 mL·g-1，每日1次，連續(xù)3 d，模型對(duì)照組在同等情況下給蒸餾水。于第3 d給藥1 h后，小鼠腹腔注射1%冰醋酸溶液0.2 mL/只。注射冰醋酸5 min后立即觀察小鼠扭體情況，記錄15 min內(nèi)扭體次數(shù)[5]。

2.5 止咳作用：對(duì)氨水致幼齡小鼠咳嗽模型的止咳作用

篩選合格小鼠：取ICR小鼠，體質(zhì)量(14.00±1.00)g，3周齡，雌雄各半，以25% 氨水超聲霧化噴霧引咳15 s，觀察小鼠從噴霧開始到出現(xiàn)腹肌收縮張嘴的時(shí)間，1.5 min 內(nèi)不出現(xiàn)咳嗽者棄去。

觀察藥物作用：將合格小鼠隨機(jī)分為9組，每組10只。各給藥組灌胃給藥，0.02 mL·g-1，每日1次，連續(xù)3 d，模型對(duì)照組在同等情況下給蒸餾水。于第3 d給藥1 h后，各小鼠以25% 氨水超聲霧化噴霧引咳15 s，以小鼠腹肌收或縮胸，同時(shí)張大嘴為咳嗽指標(biāo)，觀察各組小鼠自噴霧開始至出現(xiàn)咳嗽的潛伏期及3 min內(nèi)的咳嗽次數(shù)，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理[4]。

2.6 統(tǒng)計(jì)方法

結(jié)果采用組間比較t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理[6]。

3 結(jié)果

3.1 抗病毒作用

3.1.1 對(duì)流感病毒(FM1株)感染幼齡小鼠致肺炎模型的治療作用

采用流感病毒FM1株感染幼齡小鼠后，小鼠肺指數(shù)均明顯增高，與正常對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.01)；復(fù)方芩蘭口服液0.2、0.5、0.7、0.9 mL·(kg·d)-1劑量組均可抑制流感病毒FM1引起的肺指數(shù)增高，與模型對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05)，抑制率分別為37.63、29.36、27.47、21.55%。見表1。

表1 復(fù)方芩蘭口服液對(duì)流感病毒FM1株感染幼齡小鼠致肺炎模型的治療作用

注：與正常對(duì)照組比較，##P<0.01；與模型對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

3.1.2 對(duì)流感病毒(FM1株)感染幼齡小鼠致肺炎模型的死亡保護(hù)作用

采用流感病毒FM1株感染幼齡小鼠后，小鼠死亡率為100%；復(fù)方芩蘭口服液0.5、0.7、0.9、1.1、1.4 mL·(kg·d)-15個(gè)劑量組可降低感染所致小鼠死亡率，與模型對(duì)照組比較有顯著差異(P<0.05、P<0.01)；0.2、0.5、0.7、0.9、1.1、1.4 mL·(kg·d)-16個(gè)劑量組均可延長平均存活天數(shù)，與模型對(duì)照組比較有顯著差異(P<0.05、P<0.01)。見表2。

組別死亡率/%保護(hù)率/%平均存活天數(shù)生命延長率/%模型對(duì)照組1007.60±0.82利巴韋林組2575.00**12.75±2.24**67.76小兒感冒口服液7525.009.95±2.65**30.92復(fù)方芩蘭1.4 mL·(kg·d)-1劑量組5050.00**11.50±2.69**51.32復(fù)方芩蘭1.1 mL·(kg·d)-1劑量組4555.00**11.45±3.02**50.66復(fù)方芩蘭0.9 mL·(kg·d)-1劑量組6040.00**10.80±2.88**42.11復(fù)方芩蘭0.7 mL·(kg·d)-1劑量組6040.00**10.85±2.78**42.76復(fù)方芩蘭0.5 mL·(kg·d)-1劑量組6535.00*10.45±2.86**37.50復(fù)方芩蘭0.2 mL·(kg·d)-1劑量組7525.0010.10±2.45*32.89

注：與模型對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

3.2 抗炎作用：對(duì)冰醋酸致幼齡小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響

復(fù)方芩蘭口服液所試0.5、0.7、0.9、1.1、1.4 mL·(kg·d)-15個(gè)劑量組均可明顯抑制冰醋酸引起小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高，與模型對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.01)。見表3。

3.3 止痛作用：對(duì)冰醋酸致幼齡小鼠疼痛模型的影響(扭體試驗(yàn))

復(fù)方芩蘭口服液所試0.2、0.5、0.7、0.9、1.1、1.4 mL·(kg·d)-16個(gè)劑量組均可明顯減少醋酸致小鼠疼痛的扭體次數(shù)，與模型對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05、P<0.01)。見表4。

3.4 止咳作用：對(duì)氨水致幼齡小鼠咳嗽模型的止咳作用

復(fù)方芩蘭口服液0.2、0.5、0.7、0.9、1.1、1.4 mL·(kg·d)-1劑量組可減少氨水引起的小鼠咳嗽次數(shù)，延長咳嗽潛伏期，與模型組比較具有顯著性差異(P<0.05、P<0.01)。見表5。

表3 復(fù)方芩蘭口服液對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響

注：正常對(duì)照組比較,##P<0.01；與模型對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

表4 復(fù)方芩蘭口服液對(duì)冰醋酸致小鼠疼痛模型的影響

注：與模型對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

表5 復(fù)方芩蘭口服液對(duì)氨水致幼齡小鼠致咳嗽模型的止咳作用

注：與模型對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

4 討論

流感病毒是一類重要的，在世界范圍內(nèi)具有高發(fā)病率和高死亡率的呼吸道病毒，也是小兒病毒性肺炎的主要病原體。幼兒由于受到解剖生理學(xué)特點(diǎn)、呼吸系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)發(fā)育不成熟等因素影響，一旦感染流感病毒，臨床上常出現(xiàn)發(fā)病急，持續(xù)高熱，咳嗽喘息，甚至喘憋等癥狀，若不能及時(shí)治療，嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致死亡[7]。

目前防治流感的西藥耐藥性日益嚴(yán)重，而用于治療小兒流行性感冒的有效中藥復(fù)方制劑也相對(duì)缺乏[8]。復(fù)方芩蘭口服液為已上市的成人用藥，臨床上常被用來治療兒童流感，但說明書中對(duì)于兒童用量的表述為“小兒酌減或遵醫(yī)囑”，沒有明確的兒童使用劑量。本研究根據(jù)成人用藥換算兒童用藥的換算方法，設(shè)定1～12歲兒童的用藥范圍、采用甲型流感病毒(H1N1亞型)FM1株感染幼齡小鼠造成病毒性肺炎模型及毛細(xì)血管通透性實(shí)驗(yàn)、扭體實(shí)驗(yàn)和氨水引咳實(shí)驗(yàn)研究復(fù)方芩蘭口服液對(duì)幼齡小鼠的抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)痛、止咳作用，從而對(duì)已設(shè)定的劑量范圍的有效性進(jìn)行評(píng)價(jià)，初步探討兒童用量的最佳劑量范圍，為兒童臨床用藥提供有效性及用法用量的參考。

復(fù)方芩蘭口服液主要成分為金銀花、黃芩、連翹和板藍(lán)根，具有辛涼解表，清熱解毒的功效。方中金銀花味甘性寒，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱功效，連翹味苦性微寒，具有清熱解毒、消腫散結(jié)的功效。黃芩味苦性寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效。方中的特別之處是加入了板藍(lán)根，其味苦性寒，具有清熱解毒、涼血利咽的功效，善于清解實(shí)熱火毒，與疏散風(fēng)熱藥相伍，是治療外感風(fēng)熱、溫病初起的最佳配伍。臨床應(yīng)用表明其對(duì)急性上呼吸道感染具有很好的療效[9-10]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，金銀花具有廣譜抗菌、抗病毒及解毒抗炎作用，其主要活性成分為綠原酸[11]；連翹具有抗炎、抗菌作用，其主要活性成分為連翹苷[12]；黃芩具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、解熱等作用，其主要活性成分為黃芩苷[13]。板藍(lán)根對(duì)流感病毒、革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌等均有抑制作用，還可發(fā)揮增強(qiáng)免疫力及明顯的解熱功效[14]。

本研究旨在探討復(fù)方芩蘭口服液兒童用藥的劑量范圍，故選用出生21～27 d(3周齡)，同時(shí)保證體質(zhì)量在(14.00±1.00)g范圍內(nèi)的幼齡小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。抗病毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)方芩蘭口服液0.2、0.5、0.7、0.9、1.1、1.4 mL·(kg·d)-16個(gè)劑量組均可降低感染所致小鼠死亡率、延長平均存活天數(shù)，與模型對(duì)照組比較有顯著差異(P<0.05、P<0.01)，其中0.2、0.5、0.7、0.9 mL·(kg·d)-14個(gè)劑量組肺指數(shù)明顯降低，與模型對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05)。提示實(shí)驗(yàn)設(shè)置的6個(gè)劑量范圍合理，復(fù)方芩蘭口服液在所選劑量范圍內(nèi)具有較好的抗病毒作用。

許多研究表明中藥具有多靶點(diǎn)及整體調(diào)節(jié)的特點(diǎn)，不僅具有直接抗病毒的作用，而且具有消炎、鎮(zhèn)痛、提高免疫力等功效，比單一抗病毒藥物治療更具優(yōu)勢(shì)[15]。本實(shí)驗(yàn)中扭體反應(yīng)結(jié)果表明與模型組相比，復(fù)方芩蘭口服液0.2、0.5、0.7、0.9、1.1、1.4 mL·(kg·d)-16個(gè)劑量組均可明顯減少醋酸致小鼠疼痛的扭體次數(shù)，與模型對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05、P<0.01)，提示6個(gè)劑量組均具有較好的鎮(zhèn)痛作用，0.9～1.4 mL·(kg·d)-13個(gè)劑量組鎮(zhèn)痛效果較強(qiáng)。小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性實(shí)驗(yàn)和氨水引咳實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方芩蘭口服液0.5、0.7、0.9、1.1、1.4 mL·(kg·d)-15個(gè)劑量組均可明顯抑制冰醋酸引起的小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高，減少氨水引起的小鼠咳嗽次數(shù)，延長咳嗽潛伏期，與模型組比較具有顯著性差異(P<0.05、P<0.01)。

綜上所述，復(fù)方芩蘭口服液在0.5～1.4 mL·(kg·d)-1劑量范圍內(nèi)對(duì)幼齡小鼠模型均具有良好的抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)痛、止咳的作用，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為兒童臨床用藥提供了有效性及用法用量的參考。