加味烏梅丸聯(lián)合吉西他濱對胰腺癌移植瘤細(xì)胞凋亡機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究

張惠子，黃金昶

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院，北京 100029)

胰腺癌是一種發(fā)病隱匿，惡性度高，預(yù)后差，死亡率高的消化道惡性腫瘤[1]。多數(shù)患者診斷時已經(jīng)是局部晚期或者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，失去手術(shù)機(jī)會，因此吉西他濱成為治療進(jìn)展期胰腺癌的一線化療藥物，但由于存在原發(fā)或繼發(fā)耐藥性，其臨床療效仍較差[2]。近年來，中西醫(yī)結(jié)合治療腫瘤已成為研究熱點(diǎn)，前期的研究已證實(shí)單用加味烏梅丸對胰腺癌移植瘤的生長有抑制作用，其抑瘤機(jī)制主要是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[3]。本研究旨在進(jìn)一步探討加味烏梅丸聯(lián)合吉西他濱對胰腺癌移植瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)理。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級BALB/c-nu/nu裸小鼠，雄性，5～6周齡，體質(zhì)量(20±2)g，共40只，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

加味烏梅丸由烏梅50 g，當(dāng)歸20 g，白芍30 g，細(xì)辛3 g，干姜10 g，川椒6 g，桂枝10 g，黃連3 g，黃柏10 g，黨參10 g，制附片(先煎)10 g，炒枳殼10 g，木香10 g，生黃芪30 g，壁虎(剪段)30 g組成，按《中藥藥理研究方法學(xué)》[4]附表“人和動物間按體表面積折算的等效劑量比率表”計算出裸小鼠的用量，水煎成濃度為2.0 g生藥/mL，高溫滅菌(由中日醫(yī)院煎藥室完成)，4℃?zhèn)溆茫蛔⑸溆名}酸吉西他濱(澤菲)，江蘇豪森藥業(yè)；TUNEL試劑盒，羅氏公司。

1.3 造模與分組

人胰腺癌SW1990細(xì)胞株[5]在含10%小牛血清的PRMI1640培養(yǎng)液，37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對數(shù)生長的6×107/mL細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，取0.1 mL接種于裸鼠右腋下，制備皮下移植瘤模型，成瘤率為100%。

將裸鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組，每組10只。從接種第2天開始模型組，灌胃生理鹽水0.4 mL/只/天，共21 d；中藥組，灌胃加味烏梅丸0.4 mL/只/天，共21天；化療組，吉西他濱按100 mg/Kg，腹腔注射0.2 mL，每周1次，共2次；中藥+化療組，給藥方法同中藥組、化療組。

2 方法

2.1 瘤體積及瘤質(zhì)量測量

從第9天開始每4天用游標(biāo)卡尺測量瘤結(jié)節(jié)的最大長徑a、短徑b及高c以計算瘤體積(V=πabc/6)，并繪制腫瘤生長曲線；21天后處死裸鼠，稱取瘤質(zhì)量，計算抑瘤率(抑瘤率=模型組平均瘤重-治療組平均瘤重/模型組平均瘤重×100%)，合并用藥效應(yīng)根據(jù)webb氏分?jǐn)?shù)乘積法計算：(fa)1.2=1-[1-(fa)1][1-(fa)2](fa)1和(fa)2分別為中藥組、化療組的抑瘤率，(fa)1.2為兩組理論相加效應(yīng)，如果合并用藥的效應(yīng)大于理論相加效應(yīng)，則表示有協(xié)同抑瘤作用[6]。

2.2 TUNEL染色

(1)用二甲苯浸洗2次，每次5 min。(2)用梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)各浸洗1次，每次3 min。(3)用Proteinase K工作液處理組織15～30 min在37℃8 min。(4)PBS漂洗2次。(5)制備TUNEL反應(yīng)混合液，處理組用50 μLTdT+450 μL標(biāo)記的dUTP液混勻；而陰性對照組僅加50 μL標(biāo)記的dUTP液，陽性對照組先加入100 μL DNase l，在15～25℃反應(yīng)10 min，后面步驟同處理組。(6)玻片干后，加50 μLTUNEL反應(yīng)混合液(陰性對照組僅加50 μL標(biāo)記的dUTP液)于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中37℃反應(yīng)1 h。(7)PBS漂洗3次。(8)玻片干后加50 μL converter-POD于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中37℃反應(yīng)30 min。(9)PBS漂洗3次。(10)在組織處加50～100 μL DAB底物，15～25℃反應(yīng)10 min。(11)PBS漂洗3次。(12)拍照后再用蘇木素復(fù)染。分化，自來水返藍(lán)。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。每張切片在高倍鏡下(40倍)定位，在非壞死區(qū)，隨機(jī)選取10個視野，采用image pro plus圖像分析軟件計數(shù)凋亡細(xì)胞，判斷標(biāo)準(zhǔn)[7]：散在分布，胞核或胞核和胞質(zhì)同時呈棕黃色，呈典型凋亡形態(tài)特征。

2.3 細(xì)胞凋亡基因Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)

采用免疫組化SP法染色檢測，具體操作步驟如下：(1)用二甲苯浸洗2次，每次15 min；用梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)各浸洗1次，每次1 min；(2)PBS漂洗2次；(3)0.3%的H2O2加蓋浸洗15 min；(4)PBS浸洗3次；(5)滴加一抗：鼠抗人Bcl-2、Bax蛋白單克隆抗體稀釋為1∶500，濕盒中4℃冰箱過夜；(6)PBS浸洗3次；(7)滴加二抗：兔抗鼠抗體，濕盒中37℃反應(yīng)30 min；(8)PBS浸洗3次；(9)浸入DAB工作液中顯色，于光學(xué)顯微鏡下觀察；(10)Harris蘇木素復(fù)染色15s；(11)自來水洗10 min；(12)梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片；每張切片在高倍鏡下(40倍)定位，在非壞死區(qū)，隨機(jī)選取10個視野，采用image pro plus圖像分析軟件分析每張切片的累積光密度IOD[8]。判斷標(biāo)準(zhǔn)：Bcl-2蛋白在胰腺癌腫瘤細(xì)胞中表達(dá)于胞漿、核膜等處。Bax蛋白在胰腺癌腫瘤細(xì)胞中表達(dá)于胞漿等處。陰性：細(xì)胞漿和核周無著色；陽性：細(xì)胞漿及核周著色為淺黃色或棕黃色、棕褐色。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 腫瘤生長曲線

待瘤結(jié)節(jié)形成后，測量并計算瘤體積，繪制生長曲線圖。模型組及用藥組移植瘤的體積隨著時間的延長而明顯增加，但用藥組移植瘤的體積增長幅度明顯小于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見圖1)。

圖1 移植瘤生長曲線圖

3.2 瘤質(zhì)量及抑瘤率

中藥組、化療組和中藥+化療組各組的瘤質(zhì)量均小于模型組，中藥組、化療組、中藥+化療組的抑瘤率分別為24.36%、48.59%和63.88%。大于其理論相加抑瘤率61.11%，故表明加味烏梅丸與吉西他濱聯(lián)合有協(xié)同抑瘤作用(見表1)。

3.3 凋亡細(xì)胞數(shù)的結(jié)果

與模型組相比，中藥組、化療組和中藥+化療組中呈棕黃色顆粒表達(dá)的凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；其中中藥+化療組與中藥組和化療組相比，差異亦均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05),表明加味烏梅丸可協(xié)同吉西他濱誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡(見表2)。

表1 各組荷瘤鼠的瘤體積和瘤質(zhì)量的比較

注：與模型組比較，*P<0.05； 與化療組比較，#P<0.05

表2 各組荷瘤鼠腫瘤組織中凋亡細(xì)胞數(shù)比較

注：與模型組比較，*P<0.05；與中藥+化療組比較，#P<0.05

3.4 Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)結(jié)果

與模型組相比，中藥組、化療組和中藥+化療組中Bcl-2蛋白表達(dá)的著色顆粒明顯減少；差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；其中中藥+化療組累積光密度IOD為最低。而Bax蛋白表達(dá)的著色顆粒明顯增多；差異亦均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；其中中藥+化療組與化療組相比，差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明加味烏梅丸協(xié)同吉西他濱誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡的機(jī)制，可能是與凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)下降，凋亡促進(jìn)蛋白Bax的表達(dá)增多有關(guān)。見表3，圖2。

表3 各組荷瘤鼠腫瘤組織中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)結(jié)果

注：與模型組比較，*P<0.05；與中藥+化療組比較，#P<0.05

注:A：模型組；B：用藥組圖2 Blc-2蛋白表達(dá)(×40)

4 討論

黃金昶教授認(rèn)為胰腺癌的病位在肝經(jīng)，根據(jù)厥陰病的陰陽消長規(guī)律，此時為陰氣盡而陽氣始生，故胰腺癌的病機(jī)為肝陽虛，寒濕內(nèi)盛。烏梅丸是治療厥陰病的代表方，臨床上采用加味烏梅丸治療胰腺癌，主要是取烏梅性味酸平，歸肝脾經(jīng)，肝體陰而用陽，肝主升發(fā)，配當(dāng)歸、白芍以養(yǎng)肝陰，補(bǔ)肝血；厥陰肝木生于腎水而育心火，故附子補(bǔ)腎之陽，以助肝陽，黨參益肝氣；肝之陽氣在生長階段易郁而化火，故黃連、黃柏清火熱之邪，且黃連配附子，一清瀉一溫引，邪熱可盡；干姜、川椒溫化中焦寒濕；細(xì)辛、黃柏合用起沉寒，清濕熱；桂枝溫心陽，推動陽氣上升；加生黃芪補(bǔ)一身之氣血；炒枳殼、木香行氣消脹；而其中壁虎具有軟堅散結(jié)、活血化瘀、抗腫瘤的功用，為治療腫瘤的良藥[9]。現(xiàn)代藥理研究也證實(shí)了壁虎的抗腫瘤活性是通過多靶點(diǎn)，多水平共同實(shí)現(xiàn)的[10]。

本實(shí)驗(yàn)在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上增加陽性對照藥物吉西他濱，吉西他濱是目前治療胰腺癌的一線化療藥物，通過實(shí)驗(yàn)可看出中藥+化療的聯(lián)合用藥組對胰腺癌移植瘤有協(xié)同抑瘤作用，這也體現(xiàn)了中藥在配合化療期間的增效優(yōu)勢。此外，實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了加味烏梅丸的抑瘤作用是通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)的[3]。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡，有別于壞死，是維持機(jī)體平衡的重要機(jī)制。細(xì)胞凋亡在腫瘤發(fā)生，發(fā)展以及在其產(chǎn)生耐藥中發(fā)揮重要作用[11-12]。

然而細(xì)胞凋亡是一個多基因參與的、復(fù)雜的過程。本實(shí)驗(yàn)為探討加味烏梅丸促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)理，發(fā)現(xiàn)其中Bcl-2家族的表達(dá)與調(diào)控是影響細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素之一，在細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用[13]。Bcl-2家族分為抑制凋亡和促進(jìn)凋亡蛋白兩大類，Bcl-2基因是一種對細(xì)胞凋亡具有顯著抑制作用的凋亡相關(guān)基因。Bax基因抑制Bcl-2的活性，從而發(fā)揮其促進(jìn)凋亡的作用，Bax和Bcl-2蛋白結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)和相互作用，使二者在細(xì)胞內(nèi)有著密切聯(lián)系，即Bcl-2或Bax異源二聚體形成的調(diào)節(jié)是細(xì)胞凋亡調(diào)控中一個非常重要的環(huán)節(jié)。Bcl-2蛋白水平增高，可抑制細(xì)胞凋亡；而Bax蛋白水平增高，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14-15]。