綠僵菌侵染對黏蟲免疫反應的影響

郭棟 張蕾 程云霞 江幸福 羅禮智

摘要為揭示黏蟲被病原菌侵染后的免疫應答機制，本試驗分析比較了黏蟲幼蟲被金龜子綠僵菌metarhiziumanisopliae侵染后不同時間其血淋巴蛋白含量、免疫關鍵酶系（酚氧化酶PO，溶菌酶）活性、抗菌活力以及血細胞數量等免疫相關指標的變化。結果表明：受綠僵菌侵染后，黏蟲6齡幼蟲血淋巴蛋白含量在侵染初期（6h和24h）顯著高于對照，侵染48、72和96h后幼蟲血淋巴蛋白質含量顯著低于對照。且侵染后幼蟲血淋巴PO活性也呈現先升高后降低的趨勢，侵染初期（6h和24h）顯著高于對照，侵染后期除72h外與對照組無顯著差異。侵染初期（24h）溶茵酶活性也顯著升高，隨后出現下降，并于48h顯著低于對照，但在化蛹時（96h）再次上升。綠僵菌侵染后期，黏蟲的抗菌活性下降，于侵染后72h抗菌活性顯著低于對照，而侵染初期抗菌活性與對照無顯著差異。另外，綠僵茵侵染對幼蟲血細胞數量以及漿血胞比率也有顯著的影響，表現為：侵染后6h和24h血細胞總數、漿血胞比率均顯著高于對照，隨后與對照并無顯著差異。綜上，綠僵茵侵染黏蟲幼蟲初期會顯著誘導其免疫反應的啟動，體現在主要免疫指標升高，而后隨著免疫系統的破壞與能量的消耗，其免疫反應能力降低，生理活動受到干擾。

關鍵詞黏蟲;金龜子綠僵菌;免疫反應

中圖分類號：S476.12文獻標識碼：A DOI：10.16688/j.zwbh.2017132

昆蟲在繁衍過程中會因為種種原因受到外界天敵寄生或病原物侵染，其正常的生長發育受到嚴重影響。而昆蟲能在各種不同的外界環境中生存，與其自身的免疫反應有重要的關系。昆蟲作為無脊椎動物，免疫系統以先天性免疫為主。與高等動物相比，昆蟲體內缺乏更高等級的免疫球蛋白等免疫物質，但在長期的進化過程中發展出一套獨特的防御系統來阻止外來生物的侵入。除堅硬的表皮、組織外，昆蟲血淋巴系統在免疫機制中也承擔著重要的作用，其中主要包括體液免疫和細胞免疫兩大系統。當昆蟲受到外源病原物的刺激時，酚氧化酶（phenoloxidase，PO）可以參與昆蟲表皮的硬化和黑化，從而支撐和保護蟲體正常的生長發育;而當病原物進入蟲體后，溶菌酶可以導致病原體細胞壁破裂并使內容物逸出，最終病原細胞破裂死亡;抗菌肽是昆蟲被病原菌感染后，蟲體內快速產生的一種免疫誘導分子，對外源病原物具有強有力的殺傷作用;血淋巴細胞是昆蟲細胞免疫的主要執行者，血細胞的種類和數量是細胞免疫反應的重要指標，免疫血細胞可對外源異物進行吞噬、形成結節、包被和血凝等，從而參與傷口的愈合、凝結、合成及分泌免疫相關因子。因此，PO活性、溶菌酶活性、抗菌活力和免疫血細胞數量等免疫指標的變化是昆蟲免疫反應的標志性參數。這些免疫反應同時也會影響昆蟲的資源分配并可能改變其行為或發育方向，從而影響種群動態。

黏蟲Mythimna separata（Walker）是一種典型的季節性遠距離遷飛害蟲，是嚴重威脅我國主要糧食作物生產安全的重大害蟲。黏蟲發生范圍廣，為害世代多，除2012年和2013年連續在全國大發生外，近年來，在我國局部地區同樣暴發成災。而在全國開展的黏蟲為害調查顯示，幼蟲表皮發生黑化可作為成災種群典型的預警信息。黑化幼蟲抵抗天敵和病原物入侵的能力明顯增強，一些常用的生物制劑對其防治效果不明顯。研究發現，黏蟲幼蟲黑化是一種典型的密度依賴型現象，黑化幼蟲適應能力的增強主要體現在取食量大、抗逆能力增加和由其發育而來的成蟲遷飛能力提高等方面，從而導致生產上為害更加嚴重。近年研究也發現高密度飼養的幼蟲表皮黑化程度明顯高于單頭飼養的黏蟲，較高密度飼養的黏蟲（10頭/瓶）抵抗傘裙追寄蠅Exorista civilis Rondani的寄生和綠僵菌侵染的能力明顯增加，其6齡幼蟲表皮和血淋巴酚氧化酶（PO）的活性也顯著高于單頭飼養的黏蟲，這些結果初步明確了PO活性的增加是高密度幼蟲黑化及抗病能力提高的關鍵因素。然而，目前對黑化黏蟲的研究多集中在生長發育和行為變化方面，關于黑化黏蟲防御的免疫應答機制方面還未有報道。因此，本研究旨在通過綠僵菌侵染黑化黏蟲6齡幼蟲后測定其血淋巴蛋白質含量、PO活性、溶菌酶活性、抗菌物質和血細胞數量等免疫指標的變化，揭示黑化黏蟲的相關免疫反應，從而對指導和發展其生物防治提供重要數據。

1材料與方法

1.1材料

供試菌株：金龜子綠僵菌Metarhizium aniso-pliae（Metch.）Sor購自神威生物公司。

供試昆蟲及飼養：在吉林采集的高齡黏蟲，在實驗室繁殖6代。在飼養密度為10頭/瓶（直徑9cm×高13cm）條件下誘導出的黑化型黏蟲。幼蟲飼養參照呂偉祥等室內人工飼養方法，培養溫度為（23-1-1）℃，光周期為L∥D=14h∥10h，濕度為70%～80%，飼料為30～50cm高的新鮮玉米苗，每日更換飼料，直至幼蟲老熟為止。幼蟲老熟時瓶中加入含水量10%～15%的土壤供其化蛹和羽化。

1.2方法

1.2.1綠僵菌侵染方法

根據白毓昕的試驗結果，10⁶cfu/mL的孢子濃度可以激活黏蟲6齡幼蟲免疫反應且幼蟲不會迅速死亡，故本試驗接種用孢子懸浮液濃度設為10⁶cfu/mL。用含0.01%吐溫-80的無菌水配制該濃度的綠僵菌分生孢子懸浮液，將蛻皮24h以內的黏蟲6齡幼蟲浸于孢子懸浮液中5s后取出，放在吸水紙上吸干蟲體表面水分，然后將其置于盛有新鮮玉米葉的養蟲瓶中按1.1的方法繼續飼養，以含0.01%吐溫80的無菌水浸泡蟲體為對照。處理后每天更換新鮮葉片，去除死亡幼蟲。每個處理重復3瓶，共30頭。

3討論

昆蟲體內含有多種蛋白質，這些蛋白質不僅在昆蟲組織形成、物質代謝的過程中起著重要作用，同時與蟲體生長發育的激素調控及免疫應答機制等方面也有著密切的聯系。昆蟲蛋白通過調節機體特異性和非特異性免疫功能，發揮其增強免疫的作用，從而提高蟲體對外界刺激的抵御能力。本研究結果表明，黑化黏蟲被侵染后，血淋巴蛋白含量出現顯著的變化，表明綠僵菌的入侵刺激黑化黏蟲產生防御反應，誘導脂肪體中蛋白質的合成與分泌發生變化;同時在侵染初期蛋白含量顯著增加，推測此時黏蟲幼蟲初始接受到外源刺激，產生相關的免疫反應來抵抗綠僵菌的侵染，表現為蛋白質含量明顯增加;之后隨著免疫反應的趨緩與免疫能量的消耗，蟲體內蛋白質含量開始減少。

PO是昆蟲體液免疫中及其重要的免疫防衛因子，酚氧化酶可以催化酪氨酸產生多巴，多巴氧化為醌并最終產生黑色素。當外源生物入侵時通過特異性級聯反應而活化，產生黑化反應來提高昆蟲的抵抗能力。試驗中PO的活性隨著日齡的增加而下降，與小菜蛾幼蟲受小菜蛾顆粒體病毒PlXyGV感染后PO活性的變化規律相同;綠僵菌侵染后，幼蟲PO活性也發生顯著變化，表明幼蟲免疫水平的改變。綠僵菌侵染初期PO活性增強顯著，且在這個時期，幼蟲蛻皮后表皮開始逐漸變黑，較高的PO活性有助于蟲體防御能力的提高，同時PO介導的黑化作用來幫助幼蟲抵抗綠僵菌的侵染，并且在病原物刺激的初始階段，是蟲體內部免疫反應最活躍時期。

溶菌酶來源于昆蟲的脂肪體，釋放到血淋巴中。昆蟲處于不正常生理狀態下時，血淋巴中的溶菌酶的活性會產生極大變化。感染、出血、受傷以及各種環境壓力下，都能使溶菌酶的數量急劇增加。之后隨著免疫反應的進行，其免疫能力的消耗會導致溶菌酶活性的減少，本試驗中所得結果與許紅兵等相似，但在侵染后96h，與對照組相比，其溶菌酶活性再次升高，這可能由于幼蟲即將化蛹的原因，黏蟲對外界刺激更加敏感，誘導宿主的免疫反應來協助化蛹的進行。綠僵菌侵染后，黏蟲血淋巴中抗菌活性物質開始生成，其抗菌活力先增加后趨緩，與PO活性、溶菌酶等免疫指標的變化趨勢有所不同，這些結果表明昆蟲免疫功能之問很可能存在著相互平衡，在受到外界脅迫時，可以將有限的能量進行合理分配，從而最大化地有利于蟲體正常生長發育。

本試驗中綠僵菌侵染后黏蟲幼蟲血細胞總數目和免疫血細胞數目與比率均有不同程度的提升，與鄧日強等用核多角體病毒SpltMNPV感染斜紋夜蛾幼蟲后血細胞總數目、比率變化相同，初步表明了蟲體內細胞免疫過程的發生，而相關免疫過程如吞噬作用、形成結節、包被等免疫行為還需要進一步的研究。粒血胞和漿血胞是參與細胞免疫應答最相關的兩種細胞，侵染后黏蟲幼蟲粒血胞和漿血胞數量和比率的增加是幼蟲群體抵抗外源刺激物的適應性特征，與幼蟲免疫能力的提升密切相關。

綜上所述，對黏蟲各免疫指標的分析表明，綠僵菌侵染對黏蟲6齡幼蟲的蛋白含量、免疫酶活性、血細胞數量等生理指標有顯著影響。黏蟲幼蟲在受到侵染后，蟲體會通過體液免疫和細胞免疫的共同作用而產生防御反應。本文對黏蟲防御行為免疫應答問的關系提供了一定的理論依據，對揭示黏蟲抵抗病原物侵染的能力、機理及黏蟲成災機制具有重要意義。