雜交竹抗梢枯病誘導因子篩選及其持續期研究

何倩倩 劉雨欣 方馨玫 朱天輝 譙天敏 韓珊 李姝江

摘要本文利用病原毒素同源異質的特點誘導雜交竹抗病潛力，篩選出抗梢枯病的最佳誘導因子并排除其對病原菌的直接作用，經瓊脂玻片萌發法測定3種誘導因子（溫度滅活毒素、蛋白酶降解毒素和細胞壁成分）對雜交竹梢枯病病原茵暗孢節菱孢茵孢子萌發的抑制作用，結果顯示經過60°C滅活毒素濃度為40ug/mL處理的孢子萌發效果最為理想。通過最佳誘導因子對雜交竹不同品種誘導持續期進行測定，采用針刺法先接種誘導因子后挑戰接種病原菌，1～40d內觀察抗感品種對誘導因子響應的差異，癥狀上雜交竹8#的感病程度重于3#和6#，40d時葉片和枝干變黃干枯，病情指數結果表明，3個雜交竹品種接種誘導因子后感病程度降低，誘抗效果顯示雜交竹6#的誘抗指數高于3#和8#。以上結果證明誘導因子使不同雜交竹品種均產生了一定的抗性且抗性越強的品種誘導抗性越好。

關鍵詞雜交竹梢枯病;暗孢節菱孢菌;誘導因子;抗病性;孢子萌發

中圖分類號：S763.1，S 436.8文獻標識碼：A DOI：10.16688/j.zwbh.2018053

激發子可誘導植物自身抗性，安全性好且抗性較為穩定，持效期長，能對多種真菌、細菌和病毒病害起到抵抗作用。生物源誘導因子是來源于寄主植物或由病原物與寄主植物互作后產生的能激發寄主植物防衛反應的物質，趙繼紅等按生物化學結構不同將其主要分為寡聚糖、蛋白類激發子、糖蛋白。Ye等研究發現，先接種TMV或煙草霜霉病菌Peronos pora tabacina均可提高煙草對這兩種病的抗性。從真菌細胞壁、微生物代謝產物以及植物細胞壁等處分離得到的激發子（elicitor）也能與活菌一樣誘導植物產生抗病反應。趙繼紅等通過體外抑菌試驗及對植物幼苗活體生物測定證明了灰霉菌菌絲體提取物的防病效果可達55.6%。胡景江等研究了楊樹潰瘍病菌細胞壁裂解物一低聚糖對楊樹細胞相關抗病指標的誘導作用。李云鋒等的研究發現，接種稻瘟菌細胞壁來源的糖蛋白稻瘟菌激發子CSBI能誘導親和性與非親和性互作品種與抗病相關酶的活性增加。李洪連等報道，從誘抗菌菌絲細胞壁中獲取的激發子，與活的誘抗菌一樣能誘導黃瓜產生對炭疽病的抗病反應。因為生物源誘導因子與自然環境相容性好，因此是研究的熱點。在非生物源誘導因子方面，研究比較多的為水楊酸（SA）及其衍生物、茉莉酸（JA）及其衍生物。郭紅蓮等用不同非生物作為誘抗劑，結果表明水楊酸的誘抗效果最好。賓金華等用茉莉酸甲酯作為誘抗劑來處理煙草對抗炭疽病，明顯提高了幼苗內過氧化氫酶、苯丙氨酸解氨酶等的含量。因此這些物質也能誘導植物產生對抗病害的能力。除此之外一些物理因素如冷凍處理、高溫處理以及紫外光照射等都能夠引起植保素的產生和累積，誘導植物產生抗病性。Kubo等利用非生物因素高溫處理作為誘導因子使溫室中黃瓜的抗病能力得到了增強。李寶聚等通過高溫（40～50℃）預先對黃瓜幼苗處理1～2h，不同程度地誘導了黃瓜幼苗對黑星病Cladosporium cucumerinum的抗性。Dean等發現通過機械損傷、干冰或電磁效果等方法不同程度誘導了煙草對霜霉病的抗性。因此，誘導抗性在目前眾多植物病害控制中最具有應用潛力。

撐×綠雜交竹梢枯病是嚴重影響雜交竹生長的重要病害，導致其枯死的病原為暗孢節菱孢菌Ar-thrinium phaeospermum（Corda）M.B.Ellis。有關竹類梢枯病的研究較多，而雜交竹梢枯病大多集中于發病規律和癥狀、病原菌、培養基篩選等，對誘導抗病性方面誘導因子的篩選及寄主植物分泌物特性的研究較少。僅李姝江等以雜交竹梢枯病菌一暗孢節菱孢菌為對象，對其毒素致病組分進行確定，通過毒素粗提透析與濃縮以及對致病毒素進行分離、純化和序列分析、致病力測定等確定了純毒素的基本性質。本研究在此純毒素基礎上從溫度滅活毒素、毒素經不同蛋白酶降解及細胞壁成分對暗孢節菱孢的抑制作用這三個方面來篩選最佳誘導因子，并結合室外持續期測定病情指數及其誘抗效果，篩選出最佳誘導因子，同時也能排除滅活毒素對病原菌的直接影響。

1材料和方法

1.1供試材料

供試雜交竹品種：雜交竹3#（中抗）、雜交竹6#（抗病）、雜交竹8#（感病），栽植于四川農業大學溫室大棚。

供試真菌：暗孢節菱孢菌Arthrinium phaeo-spermum（Corda）M.B.Ellis，分離于雜交竹梢枯病竹，由四川農業大學森林保護實驗室提供。

該菌株純化毒素由四川農業大學森林保護學實驗室提供，將純化后的蛋白毒素用無菌蒸餾水稀釋成10、20、40、80ug/mL溶液。

1.2主要試劑和儀器

蘇靜安泰SW-CJ-2FD型超凈工作臺;LDZX-40BI立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋;BX51顯微鏡，奧林巴斯株式會社;BSG-800程控光照培養箱，上海博訊實業有限公司;DELTA-320pH計，北京聯合科力科技有限公司;“U”形玻棒;血球計數板;載玻片;葡萄糖;瓊脂。

1.3誘導因子篩選

孢子懸浮液的制作：取25℃培養5～7d的A phaeospermum活化菌株斜面，加入5mL無菌水，用接種環將分生孢子刮下，使其懸浮，將菌懸液在旋渦振蕩儀上振蕩10min，轉入三角瓶（含玻璃珠）中，置于搖床150r/min振蕩30min，用滅菌脫脂棉（或雙層紗布）過濾得到孢子懸浮液，適量移入1.5mL離心管中，濾液用血球計數板計數。

1.3.1溫度滅活毒素對暗孢節菱孢的抑制作用

采用玻片萌發法測定溫度滅活毒素對孢子萌發的抑制作用。純毒素分別經20、40、60、80、100℃處理15min，而后分別配制毒素終濃度為10、20、40、80ug/mL的病菌孢子懸浮液（孢子濃度數量級為10⁷），用1mmol/L NaOH調節pH至6.8。于無菌環境中取潔凈的載玻片，在滅菌并冷卻至50C左右的2%水瓊脂培養基中蘸一下，待凝成薄層后，去掉一面瓊脂培養基，將有瓊脂培養基的一面朝上，平放在培養皿的“U，形玻棒上，再將配制的病菌孢子懸浮液涂抹在培養基上，蓋上蓋玻片和培養皿。培養皿于25～28℃保濕培養，以無菌水為對照，分別在5、10和24h后測定孢子萌發率，每處理觀測100～300個孢子。

1.3.2毒素經不同蛋白酶降解后對暗孢節菱孢的抑制作用

采用玻片萌發法測定毒素經蛋白酶降解后對孢子萌發的抑制作用。純毒素分別經胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶A（羧肽酶B）、蛋白酶K處理20h（最終酶濃度為1mg/mL），然后分別配制毒素終濃度為10、20、40、80ug/mL的病菌孢子懸浮液，用1mmol/L NaOH調節pH至6.8。按1.3.1方法測定孢子萌發率。

1.3.3細胞壁成分對暗孢節菱孢的抑制作用

暗孢節菱孢菌細胞壁成分提取：菌種轉管活化接種在PDA培養皿中，于25℃培養箱中培養，挑取經PDA培養5d后的菌塊;打孔后接種于200mL已滅菌的PD培養液中，將培養7d的培養液用4層滅菌紗布在超凈臺中過濾得到菌絲體，然后用50mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0）洗滌3次，再懸浮于磷酸鹽緩沖液（含0.5%Triton-100）中，200r/min勻漿3～5rnin，中問每隔1min問歇1次;隨后4000r/min離心10min，取沉淀用乙醇洗滌，再次對其進行離心并用去離子水洗滌，最后按l g沉淀加10mL蒸餾水的比例將沉淀懸浮于去離子水中，于121℃高溫水解2h，冷卻后11200r/minN心20rain，上清液用0.22um微孔濾膜過濾，收集濾液即為細胞壁成分，低溫保存。

配制細胞壁成分終濃度為10、20、40、80ug/mL的病菌孢子懸浮液，1mmol/L NaOH調節pH至6.8。按1.3.1方法測定孢子萌發率。

1.4最佳誘導因子的效果

根據室內試驗的篩選結果，選取最佳誘導因子進行誘導抗病性持續期測定，比較最佳因子對不同品種的誘導效果。設置兩組處理：一組為先接種無菌水后接種菌懸液處理（a），對照為先接種誘導因子后接種A phaeospermum菌懸液處理（b）;另一組為先接種最佳誘導因子后再接種無菌水處理（c），對照為僅接種無菌水處理（d）。通過前人對誘導處理和挑戰接種問隔時問對誘抗效果影響的研究，確定最佳誘導效果問隔時問為3～7d，因此選擇第3天挑戰接種。調節誘導因子溶液pH至6.8，加0.05%吐溫80備用。選擇長勢均一的雜交竹上部嫩枝8條進行噴霧涂布處理，以溶液布滿嫩枝不下流為宜，套袋保濕12h，第2、3天各重復處理1次，以確保誘導因子能夠被植株有效吸收。以無菌水為對照。每個品種分別處理15株，于最后一次處理后的第1、3、5天針刺接種暗孢節菱孢菌（針刺部位在嫩枝頂端節叉處，不刺穿為宜），傷口處滴一滴菌液，約0.05mL;套袋保濕，于接種后1、3、5、10、15、20、25、30、35、40d調查發病情況，按照下列方法計算病情指數及其誘抗效果。病情分級標準：0級：無枯萎;1級：25%以下枝枯;2級：25%～50%（包含25%和50%）枝枯;3級：50%～75%枝枯（包含759/6）;4級：75%以上枝枯。

病情指數=[∑（各病級數×病枝數）/（總枝數×發病最重的病級數）]×100;

誘抗效果=[（對照病情指數一處理病情指數）/對照病情指數]×100%。

2結果與分析

2.1雜交竹梢枯病病害癥狀及病原菌形態特征

暗孢節菱孢菌Arthrinium phaeospermum（Corda）M.B.Ellis為雜交竹梢枯病的病原菌，感病的雜交竹竹梢的某一節或某一枝條的節杈處出現褐色舌形或菱形病斑且在枝干上生成分生孢子器。該病原菌在PDA培養基上氣生菌絲發達，棉絮狀，初為白色，后逐漸變為灰白色，菌落底部可呈褐色。顯微鏡下該病原菌的孢子為暗褐色，分生孢子單細胞，圓形、橢圓形或透鏡狀（橄欖形），以圓形為多，而透鏡狀（橄欖形）分生孢子中問有1條無色的發芽縫。

2.2誘導因子的篩選

通過玻片萌發法對3種誘導因子處理后的孢子萌發進行不同時問段觀察，以清水作為對照，發現5h時對照和經過誘導處理的孢子萌發存在一定的差異，且24h時差異較明顯。分生孢子在清水中5h已經開始萌發，且萌發力較強。萌發時孢子端略開口，從各個端口長出菌絲狀的芽管甚至有3～4條芽管的，在24h已基本萌發完全。而處理組在5～10h也開始萌發但萌發較慢，24h清水中和溫度滅活的孢子芽管均較長且開始分叉（圖2）。

2.2.1溫度滅活毒素對暗孢節菱孢菌的抑制作用

毒素經過不同溫度滅活后設置梯度濃度，在5、10h和24h觀察孢子萌發率。由表1可見，毒素在經過60℃及以上溫度處理后，幾個梯度濃度下的孢子5h時均已萌發，甚至部分處理萌發率達到了50%，10h時已經萌發約70%，24h萌發率為70%～84.3%;而毒素經過40℃及以下溫度處理后，5h時僅有30%左右的孢子萌發，10h時萌發約50%～60%，24h達到56.3%～82.0%。毒素在20℃和40℃處理下不同濃度作為誘導因子對孢子萌發均有明顯的抑制作用，80ug/mL的濃度抑制效果突出。毒素在100℃滅活下不同濃度作為誘導因子孢子萌發率均與對照相近，且不同處理孢子萌發率不存在顯著差異。在60℃處理下20、40ug/mL均與對照萌發率接近，特別是40ug/mL的5、10h和24h孢子萌發率分別為51.3%、70.6%和84.3%與對照僅相差0.8、1.9和1.2百允點，5h時萌發率甚至高于對照。而10、80ug/mL濃度下抑制作用較大，孢子萌發率低于40ug/mL，因此選用最佳因子為毒素在60℃下滅活且濃度為40ug/mL。

2.2.2毒素經不同蛋白酶降解后對暗孢節菱孢的抑制作用

由表2可見，毒素經過4種不同蛋白酶處理后在同一時問段不同濃度處理與對照有顯著差異，且隨著濃度的升高抑制效果更加明顯。毒素經過胰蛋白酶、K蛋白酶、羧肽酶處理作為誘導因子配制梯度濃度，均為濃度20ug/mL的孢子萌發效果較好，尤其在10h時胰蛋白酶處理的與對照僅差5.2百分點，但在24h時差距達到了10.2百分點。而糜蛋白酶處理下濃度10ug/mL的孢子萌發效果較好，24h時孢子的萌發率高于其他3種酶處理下的，但也只達到76.0%，與對照85.5%差異顯著。

2.2.3細胞壁成分對暗孢節菱孢的抑制作用

從表3可以看出細胞壁成分對孢子萌發的影響，隨著時問的延長孢子萌發率的差異越來越明顯。20ug/mL處理相比其他濃度萌發效果較好，在10h和24h時萌發率分別達到60.0%、69.3%，與對照72.5%、85.5%相差12.5百分點和16.2百分點，且同一時問段隨著濃度的提高孢子萌發率顯著降低。

通過玻片萌發法觀察誘導因子對病原菌暗孢節菱孢菌孢子萌發的影響，發現3種誘導因子對孢子萌發均有一定的抑制作用。在毒素經過溫度滅活作為誘導因子組中，萌發效果較好的為經過60℃滅活、毒素濃度為40ug/mL處理，其24h時的萌發率為84.3%。在毒素經過4種蛋白酶降解作為誘導因子組中，萌發效果較好的為糜蛋白酶處理下毒素濃度10ug/mL，24h時的萌發率為76.0%。在細胞壁成分作為誘導因子組中20ug/mL的孢子萌發效果較好，24h時的萌發率為69.3%。

從以上結果可以看出，不同蛋白酶對毒素處理和細胞壁提取物不同濃度處理對病原菌暗孢節菱孢菌的孢子萌發均有抑制作用，溫度滅活處理80C和40℃及以下溫度對孢子萌發也有抑制作用，而100℃溫度處理孢子萌發與對照不存在顯著差異。因此，最終選擇經過60℃滅活毒素，濃度為40ug/mL作為最佳誘導因子。

2.3室外持續期病情指數和誘導效果比較

2.3.1雜交竹不同品種誘導后的癥狀

通過圖3得出，接種后，經過40d持續觀察，3個不同雜交竹品種的癥狀表現均不同。對于3個不同雜交竹品種，雜交竹8#的感病程度高于其他兩個品種。從a組來看雜交竹8#的葉片幾乎全部變黃枯萎枝干也全部干枯，3#葉片大多數變黃枯萎但枝干僅干枯少部分，而6#僅有少數葉片變黃枝干未見干枯。b和c組病情指數均有降低，但8#的葉片變黃枯萎程度依然高于3#和6#。

2.3.2雜交竹不同品種不同處理誘導后的病情指數

從圖4中變化動態得知，CK2組上升的趨勢高于處理組1、CKl和CK3，1～10d緩慢上升，10～30d上升的幅度變大，30～40d上升的幅度又開始減緩。CK2中雜交6#的病情指數在40d時增加到了37.69，而雜交3#增加到了48.38，雜交8#增加的最高，達到了63.15。圖中也看出CK28整個觀察時問段折線一直處于最高。3#、6#和8#對應的折線變化趨勢與CKl-3#、CKl-6#和CKl-8#相近，1～30d有緩慢的上升趨勢，30～40d趨于穩定。3#、6#、8#在40d時病情指數分別為25.42、19.71和32.43，相比CK2低了17.98、22.96、30.72。CKl的3個雜交竹品種40d時與CK2相比病情指數也分別低了16.88、22.26和29.9。而CK3整個時問段變化不明顯波動，幅度也不大，病情指數也最低，3#、6#和8#分別為13.46、9.08和19.49。

2.3.3雜交竹不同品種誘導后的誘抗效果

通過圖5可看出10～25d期問3條直線都是升高趨勢，25～40d趨于穩定，這可能是開始病原菌對寄主植物造成一定的傷害，后誘導激發了寄主植物自身的抗性，增強了對抗逆境的能力。抗性品種的誘抗指數折線圖整個時問段一直高于感病品種。從6#的誘抗效果動態變化來看，1～10d折線先降低，10～20d有緩慢的上升趨勢，20～40d穩定，此時的誘抗指數穩定在49.23%左右。3#誘抗指數在1～5d從46.97%降到了38.12%，5～25d又升高到了46.99%，30～40d穩定在48.53%左右。8#在1～5d誘抗指數穩定于26.92%左右，10～35d有較大幅度的上升，平均值達到了47.10%。總之，雜交6#的折線在整個時問段均高于雜交3#和雜交8#，而雜交8#相對于雜交6#、雜交3#兩個品種折線波動幅度變化更大，尤其在5～25d呈直線上升趨勢，雜交6#誘導處理后變化幅度最小。

通過圖4病情指數比較得知，3個不同雜交竹品種在4種不同處理方式中均呈現CK3植株的病情指數最低，CK2的病情指數最高。處理組1的病情指數低于CK2，表明誘導因子使植株抗性增加。而圖5誘抗效果比較得出，雜交竹6#整個時問段的誘抗平均值達到了50.16%，高于雜交竹3#和8#，說明抗性品種對誘導因子的響應更明顯。

3結論與討論

3.1不同誘導因子對病原茵孢子萌發影響不同

誘導因子又稱為誘抗劑、激發子，是靠誘導物獲得抗性。它與自然獲得抗性具有相同的抗病譜，且誘導產生的抗性與自然產生的抗性和機理是相同的，誘導物本身對病原物沒有直接殺傷作用，是能夠誘發植物產生抗病防衛反應的物質。葛銀林、李洪連、李開本等的研究表明，激發子是能夠誘導植物產生抗病反應（或植保素）的特殊物質，而May-ama、Ehrenshaft、Moussatos、章元壽、董金皋等的研究結果說明毒素可以作為激發子增加植物體內的抗病物質，起著與受體問相互識別的作用。本試驗選用溫度滅活的毒素、經過不同蛋白酶處理的毒素和病原菌細胞壁成分作為3種誘導因子，對誘導因子設置不同濃度梯度，采用玻片萌發法觀察其對病原菌孢子萌發的影響。經過細胞壁成分處理的孢子在5h時平均萌發率為16.25%，經過蛋白酶處理毒素后的孢子平均萌發率為18.29%，經過溫度滅活處理毒素的孢子萌發率為19.09%，與對照相比孢子萌發率均低于清水中的萌發率，但經過溫度滅活處理毒素的孢子萌發率更接近清水中孢子萌發率，而相比5h時細胞壁成分對病原菌有明顯的抑制作用。10h同樣溫度滅活毒素與清水中孢子萌發率接近，因此最佳誘導因子選用溫度滅活的毒素。

確定選用溫度作為最佳誘導因子后，對溫度設置梯度20、40、60、80、100℃分別對毒素滅活，進而觀察不同溫度滅活后對病原菌孢子萌發的影響。由表1可知100℃滅活毒素后觀察病原菌孢子萌發率均與清水對照差異不顯著，可能毒素已經全部失活，20、40、80℃滅活毒素孢子萌發率與清水存在顯著差異，而60℃滅活毒素在20、40ug/mL的濃度下孢子萌發率與清水不存在顯著差異，孢子萌發效果較好，毒素濃度10、80ug/mL處理孢子萌發率與清水存在顯著差異，因此選用60℃作為最佳溫度。

對純毒素經過60℃滅活后設置梯度濃度10、20、40、80ug/mL觀察不同濃度對病原菌孢子萌發的作用。在這4個不同濃度梯度中40ug/mL與清水對照不存在顯著差異且萌發效果最好，因此40ug/mL為最佳濃度處理。

綜上所述，選出的最佳誘導因子為純毒素經過60℃滅活處理、毒素濃度為40ug/mL。3.2不同雜交竹品種誘導抗病性存在差異

Dean、Okuno、冉隆賢、蔡新忠、李紅玉等的研究表明，在一定的濃度范圍內誘導因子與抗性寄主植物的誘導抗病性效果存在正相關關系，抗性越強的品種誘導抗性越好。劉亞光等研究認為灰斑病菌和粗毒素對抗病品種誘導作用強于感病品種。王敬文等研究PAL在抗馬鈴薯晚疫病中的作用發現，無論病原菌還是病原菌毒素處理，PAL的活性大小與品種抗病性呈正相關。因此對于大多數情況而言，在最佳誘導因子的誘導作用下，抗性品種的誘導抗性要高于感病品種且在一定的時問段后，誘導效應不再增強而趨于穩定。然而對于不同的寄主植物誘導抗病性也存在差異，前人的研究大部分都是針對農作物、經濟作物等的幼苗期進行誘導處理的，本試驗所選定的研究對象是禾本科植物雜交竹。

本試驗用室內試驗篩選的最佳誘導因子作用于不同雜交竹品種，觀察接種后1～40d的病情指數和誘抗效果。從不同雜交竹品種病情指數和誘抗指數的變化圖（圖4、5）可看出，經過最佳誘導因子誘導后，各品種病情指數和誘抗效果存在差異。3個不同抗性品種在1～40d的誘抗指數平均值分別為雜交竹6#50.16%，雜交竹3#44.77%，雜交竹8#38.64%，結果與前人的研究相似。雜交竹6#和3#在誘導后1～5d誘抗指數有降低的趨勢，5d之后開始上升，25～40d趨于穩定，此時誘抗指數為48.459/6。雜交竹8#對誘導因子反應較為緩慢，1～5d沒有變化，5d之后迅速呈直線上升，最終穩定時的誘抗指數為47.54%。雜交竹8#感病品種呈直線上升可能是因為誘導因子對某些生化物質的誘導速度快于抗病品種，但最終的誘抗效果依然是抗病品種高于感病品種。