甾醇載體蛋白2抑制劑的研究進展

陶濤 杜馨

摘要農業害蟲對殺蟲劑抗性的持續增加，嚴重威脅著農業可持續發展和人類生存。高效、安全的新型農藥的創制是有效控制害蟲的重要保證。膽固醇是昆蟲細胞膜和脂蛋白的重要組成成分，是類固醇激素的合成前體。但昆蟲本身缺乏合成膽固醇的關鍵酶，無法從頭合成膽固醇，需要從植物中攝取。甾醇載體蛋白2（SCP-2）在昆蟲轉運膽固醇的過程中起著關鍵作用。SCP-2可以作為篩選高效安全新農藥的潛在靶標。本文就近幾年篩選出的甾醇載體蛋白2抑制劑進行了總結。

關鍵詞甾醇載體蛋白2;害蟲防治;新農藥創制;篩選方法;抑制劑

中圖分類號：S48文獻標識碼：A DOI：10.16688/j.zwbh.2018210

膽固醇作為類固醇激素的合成前體，同時作為細胞膜和脂蛋白的重要組成成分，在昆蟲的生長、變態發育以及繁殖過程中起著重要作用。昆蟲體內缺少從頭合成膽固醇所需的羊毛甾醇合酶和鯊烯單氧化酶，而哺乳動物可以通過甲羥戊酸途徑從頭合成膽固醇。已知的參與膽固醇轉運的蛋白質有很多種，其中甾醇載體蛋白2（SCP-2）蛋白作為重要的轉運蛋白，對昆蟲體內類固醇激素的合成具有重要作用。阻斷昆蟲體內膽固醇的獲取途徑是研發新型殺蟲劑的有效方向。

1甾醇載體蛋白2（SCP-2）

SCP-2，一種非特異性的固醇轉運蛋白，是一類相對分子量較小的膽固醇、磷脂、脂肪酸、脂酰CoA等胞內轉運蛋白。1980年，Noland等首次從小鼠肝臟中提取出SCP-2蛋白，發現其能夠激活膽固醇水解酶，以此來改變細胞膜內外膽固醇的濃度，而且在體外培養組織系統中，SCP-2能夠影響膽固醇的運輸。

SCP-2在脊椎動物、昆蟲、植物、微生物、軟體動物中均有分布。黑腹果蠅Drosophila melano-gaster、埃及伊蚊Aedes aegypti、棉貪夜蛾Spodopteralittoralis、家蠶Bombyx mori、斜紋夜蛾Spodoptera li-tufa、煙草天蛾Manduca sexta、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera等昆蟲的SCP-2基因都已經被克隆。對SCP-2的亞細胞定位研究發現，部分上述昆蟲的SCP-2主要存在于中腸細胞中。SCP-2與膽固醇結合的體外研究發現，SCP-2在膽固醇攝取、細胞內運輸、酯化和氧化中起作用。SCP-2具有典型的外部親水內部疏水結構，由4～5個a螺旋和β折疊圍繞組成一個疏水腔，膽固醇、脂肪酸、植物甾醇等多種脂質可以與其結合。SCP-2可以通過C端a螺旋的結構變化來實現脂質的結合和釋放，且與不同底物具有不同的結合方式。

甾醇載體蛋白抑制劑主要通過競爭結合的方式抑制載體蛋白與脂質的結合。迄今為止，甾醇載體蛋白抑制劑的知識大部分集中在蚊子研究中。與埃及伊蚊SCP-2（AeSCP-2）類似，脊椎動物SCP-2蛋白結合膽固醇和脂肪酸。同樣地，AeSCP-2和脊椎動物SCP-2的過表達都增加了細胞中膽固醇的量。雖然SCP-2抑制劑可以抑制SCP-2與膽固醇、脂肪酸、植物甾醇等的結合和轉運的過程，但脊椎動物SCP-2活性的降低并不影響小鼠的正常生命活動，故埃及伊蚊SCP-2抑制劑（AeSC-PIs）在正常脊椎動物細胞中幾乎沒有毒性，可以推斷其在人體中無毒或毒性較低。將昆蟲體內甾醇載體蛋白2作為靶標，阻斷植物甾醇獲取途徑，是開發新殺蟲劑的有效方法。

2篩選抑制劑的方法

目前抑制劑篩選的方法主要分為實物篩選和虛擬篩選。實物篩選是通過帶熒光標記的膽固醇和待篩抑制劑同時與SCP-2進行結合，通過對熒光物質的濃度變化進行檢測，即可測得抑制劑的抑制效果。常用的有NBD膽固醇和免疫膠體金。

虛擬篩選的方法分為四種：（1）隨機合成篩選法;（2）類同合成法;（3）天然活性物模擬法;（4）生物合理設計法。其中生物合理設計法是利用靶標在生物體內的關鍵生理生化作用，篩選設計合成影響靶標的化合物，再對其中潛在藥物前體的結構進行不斷優化來開發新農藥。該方法具有針對性強、效率高的特點，在實際研究中被大量使用。隨著生物信息學和高通量篩選技術的快速發展，通過計算機進行藥物篩選提供了一種更高效、安全、經濟的方法。與實物篩選需要相應的儀器設備和試驗時問長不同，虛擬篩選耗時短但需要大型的電腦或處理器來進行數據處理。在目前篩選抑制劑時，根據試驗條件的不同可以選擇不同的篩選方法。

3已篩選出的SCP-2抑制劑

3.1埃及伊蚊SCP-2抑制劑

Lan Que課題組將純化后的埃及伊蚊SCP-2（AeSCP-2），利用帶有NBD熒光標記的膽固醇（簡稱NBD膽固醇）與膽固醇的競爭結合作用進行高通量篩選，由于膽固醇的環狀戊烷基團將其親水的羥基包圍，膽固醇呈疏水性，故SCP抑制劑（SCPI）的共同特征是它們相對疏水，分子量較小且接近于膽固醇。篩選出5種具有SCPI活性的化合物，測量得其對AeSCP-2的結合親和力SCPI-5>SC-PI-2>SCPI-4>SCPI-3>SCPI-1，并測定了每種化合物對SCP-2的半數抑制濃度（IG50）（見表1）。生物活性測定表明，SCPI對埃及伊蚊具有很高的致死率，對耐Bt蛋白的埃及伊蚊也有一定致死作用，其中SCP>I對多種蚊子和一些鱗翅目昆蟲的幼蟲都有致死效應（表1）。

Thiyagesan等根據AeSCP-2的三維結構從Argus Lab小分子庫中篩選出133種植物化學分子，再使用對接軟件Autodock進行對接試驗，篩選出了2種結合能最低（panthenol，triterpenoid），且穩定的有效抑制劑（表1）。Senthilraja和Kan-dasamy根據AeSCP-2的三維結構，利用Argusdock在13種紅樹林衍生物中篩選出了2種結合能最低且與活性位點結合較好的抑制劑。這2種抑制劑對環境污染較小，成本低，且對蚊子幼蟲的生長有一定的抑制作用（表1）。

在植物源SCP-2抑制劑的研究中，α-倒捻子素是一種不溶于水但溶于戊烷、甲苯、石油醚等低極性有機溶劑的植物源物質，其作為埃及伊蚊SCP-2抑制劑，對多種蚊子的幼蟲都具有致死效應，半數致死劑量分別達到4.8、52、14.1、14.9、38.7unol/L（表1）。

姜黃素是提取自姜科或天南星科中的一些植物根莖中的一種化學成分，其本質為二酮類化合物，具有明顯的疏水性。有報道發現姜黃素及其類似物對AeSCP-2活性有抑制作用，同時對幼蟲有一定的致死效果?？s氧硫脲類藥物對AeSCP-2的親和力也較高，具有較好的殺蟲活性（表1）。

3.2斜紋夜蛾SCP-2抑制劑

在鱗翅目斜紋夜蛾的研究中，通過虛擬篩選得到了4種斜紋夜蛾SCP-2（S1SCP-2）抑制劑，具有對S1SCP-2的高親和力，且在生物活性測定中發現對幼蟲生長具有抑制作用（表1）。

3.3棉鈴蟲SCP-2抑制劑

通過高通量虛擬篩選從218780種化合物中篩選出9種具有棉鈴蟲SCP-2抑制劑活性的化合物（H1、H7、H14、H19、H24、H28、H29、H37和H43），這些抑制劑在分子的一端或兩端都有苯環或鹵代苯環等疏水基團。在對這些抑制劑進行初步生物活性測定后選擇其中5種（H1、H14、H7、H29和H19）進行深入測定，發現5種抑制劑在不同濃度下對幼蟲的最高致死率分別達到50%、54%、17%、33%和48%（濃度分別為625、125、625、25umol/L和25umol/L。經處理后的幼蟲相較于對照組生長周期延遲3～5d，成蟲的體重下降約50%，產卵量也有不同程度的降低（20.5%～88.3%）。進一步對H1和H14進行生物測定結果表明，這兩種化合物對棉鈴蟲幼蟲的生長具有不同程度的抑制活性，且隨著抑制劑濃度的增加，幼蟲的平均體重下降。濃度為125umol/L時第7天H1和H14處理組的死亡率分別為46%和50%（表1）。

4總結與展望

由于傳統農藥在使用中產生的一系列問題，新型殺蟲劑成為更符合人類發展的新選擇。通過抑制SCP-2來達到殺蟲的目的是研發新型殺蟲劑的有效途徑。目前大量研究都集中于蚊子中，但由于不同昆蟲的SCP-2結構存在一定的差異，所以對于其他害蟲SCP-2抑制劑的研究還有待加強。篩選新的SCP-2抑制劑，需要根據不同物種的SCP-2進行活性位點的分析，找到其活性氨基酸殘基，同時還需要考慮蛋白質的變構效應，應當使用與配體結合后SCP-2的構象進行對接分析。結合親和力的影響因素包括靜電作用、溶劑化作用與反溶劑化作用、受體配體本身的分子結構改變等。運用適當的評價方法對結合親和力進行評價后選出候選抑制劑。目前已篩選出來的抑制劑對昆蟲生長、變態發育和繁殖都表現出一定的抑制作用。在動物細胞試驗中，部分抑制劑對小鼠無毒害作用但其對環境和人體的影響還未經過驗證。在確定對環境和人體無明顯影響后，還要對其成藥性進行研究，直至形成殺蟲劑產品。綜上所述，在新型殺蟲劑領域，基于SCP-2抑制劑的新型殺蟲劑研究具有巨大空問和潛力。