丹參組織培養及快速繁殖

董靜靜，白鳳麟，劉瑞祥，雷海英，竇彩霞

（長治學院生物科學與技術系，山西長治046011）

丹參（Salvia miltiorrhizaBge.），又名紫丹參、血參、大紅袍等,為雙子葉唇形科（Labiatae）鼠尾草屬多年生草本植物[1]，主要以干燥根及根莖入藥[2]。目前，從丹參中分離到的化學成分有100多種，分為水溶性和脂溶性2類。研究發現，發揮丹參藥理藥效的主要成分是水溶性的酚酸類和脂溶性的丹參酮類[3-5]。丹參酮類是一類松香烷型二萜醌類化合物，主要包括丹參酮I、丹參酮IIA、丹參酮IIB、隱丹參酮、異丹參酮I、異隱丹參酮[6-8]；丹參酮類物質大多從丹參根莖中提取得到[9]。此外，丹參還含有黃酮類、三萜類等成分，具有改善循環、抑制血小板凝聚、減少心肌損傷和抗氧化的作用[10-14]，常配伍用于治療心腦血管疾病炎癥、肝硬化等[15-17]。近幾年，隨著我國心腦血管類疾病發病率的上升，丹參的需求量逐年增加[18-19]。

本研究以丹參葉片為外植體，通過設置培養基的激素種類和濃度梯度，探索有效獲得丹參葉片愈傷組織高誘導率、較佳生長速度的激素配比，從而得到一套實用的丹參快速繁殖技術，旨在為改良丹參質量、提高丹參產量和有效成分以及為丹參種植提供技術支持。

1 材料和方法

1.1 材料與主要試劑

供試丹參葉片來源于山西振東道地藥材開發有限公司。主要試劑有氯化汞，無水乙醇，95%乙醇，2，4- 二氯苯氧乙酸（2，4-D），6- 芐氨基腺嘌呤（6-BA），MS培養基所需藥品，蔗糖，氯化鈉，瓊脂粉，氫氧化鈉，萘乙酸（NAA），吲哚丁酸（IBA）。

1.2 試驗方法

1.2.1 丹參葉片消毒 采集大田生長的丹參葉片，用自來水沖洗掉表面的泥沙，放在超凈工作臺進行進一步消毒。將外植體放在無菌的培養皿中，用75%的酒精浸泡10 s左右，用無菌水漂洗3～4次，每次1～2 min；向培養皿中加入0.1%的氯化汞溶液，振蕩浸泡10 min，倒去浸泡過材料的氯化汞，用無菌水漂洗3～4次，每次1～2 min，并用無菌鑷子不停攪拌。

1.2.2 丹參葉片愈傷組織的誘導 將丹參葉片剪成0.5 cm×0.5 cm的小塊，用無菌濾紙吸掉葉片表面水分并放入無菌培養皿中，使用無菌鑷子接種于附加不同濃度6-BA和2，4-D的MS固體培養基上（表1），記錄愈傷的增殖效應以及后期的長勢情況。在黑暗條件下誘導形成愈傷組織，培養溫度為（25±1）℃。每隔5 d觀察一次外植體的生長狀況，統計初始愈傷時間、染菌個數，計算愈傷組織誘導率。

表1 不同濃度激素配比的愈傷組織誘導培養基

1.2.3 不同激素配比對誘導芽的影響 將愈傷組織繼代培養后，挑選長勢良好的愈傷組織，接種于附加不同激素濃度的MS固體培養基[20]（表2），記錄愈傷的增殖效應以及后期的長勢情況。培養溫度為（25±1）℃，光照培養，記錄不同濃度梯度培養基上最早的出芽點時間以及后期芽的長勢情況。30 d后，計算愈傷組織的萌芽數和萌芽率。

表2 不同濃度激素配比的愈傷組織芽誘導培養基

2 結果與分析

2.1 不同激素配比對丹參葉片愈傷組織的影響

把葉片接種在2，4-D質量濃度為0.5 mg/L、6-BA質量濃度分別 0.5，1.0，1.5，2.0 mg/L的 MS培養基上進行愈傷組織誘導，結果表明，當6-BA質量濃度為0.5，1.0 mg/L時，丹參葉片長出愈傷組織時間最長，需要20 d左右，但其愈傷質量不佳；6-BA質量濃度為1.5，2.0 mg/L時，出愈時間約14 d，愈傷組織呈淡黃色且較大，無褐化現象（表3）。

表3 不同濃度激素配比對丹參葉片愈傷組織誘導的影響

把葉片接種在6-BA質量濃度為1.0 mg/L、2，4-D質量濃度分別為 1.0，1.5，2.0，2.5 mg/L的 MS的培養基上，結果表明，當2，4-D質量濃度為1.0mg/L時，愈傷組織長勢良好，呈淡黃色；當2，4-D質量濃度為1.5 mg/L時，愈傷組織較大，呈淡黃色，致密，無褐化，愈傷增殖快；當2，4-D質量濃度為2.0 mg/L時，葉片長出愈傷時間最短，大約7 d，葉片切口皺縮、變厚，開始從葉片切口長出愈傷組織，且愈傷呈現淡黃色，生長后期愈傷組織不僅增殖快，而且沒有分化出芽，不褐化；當2，4-D質量濃度為2.5 mg/L時，愈傷組織雖然長勢快，但是褐化比較嚴重?？赡苁怯捎?，4-D質量濃度過高，導致愈傷組織內多酚氧化酶活性升高，而使愈傷組織褐化[21]。可見，2，4-D對愈傷組織的誘導影響較大，最適質量濃度范圍是1.0～2.0 mg/L，濃度太低不利于誘導愈傷，濃度太高會影響愈傷質量；增加6-BA濃度可以增加出愈率，但后期愈傷長勢不佳。綜合考慮，MS＋1.0 mg/L6-BA＋2.0 mg/L2，4-D可作為誘導丹參葉片愈傷組織的最佳培養基（表3）。

2.2 不同激素配比對丹參愈傷組織誘導芽的影響

選取在誘導培養基上長勢最好的愈傷組織誘導芽，進而探索不同激素濃度梯度對誘導芽的影響。由表4可知，在單獨使用6-BA誘導芽時，愈傷組織增殖速度快，6 d左右愈傷組織明顯長大，但是褐化現象嚴重，并且有大部分愈傷分化出根。說明6-BA單獨使用不利于誘導芽。在添加6-BA的基礎上再添加NAA，觀察6-BA和NAA這2種激素配比對誘導芽的影響，結果發現，沒有長根現象發生，約4 d后在2.0 mg/L6-BA＋0.25 mg/LNAA的培養基上最先出現芽點，10 d后愈傷組織全部呈現淡綠色；7 d后，在1.5 mg/L 6-BA＋0.25 mg/L NAA培養基上出現芽點；而0.5mg/L6-BA＋0.25mg/LNAA和1.0mg/L6-BA＋0.25mg/LNAA的培養基上約15d才出現芽點。說明2.0 mg/L的6-BA與一定濃度的NAA配比使用能較高效率地誘導芽。

表4 不同濃度激素配比對丹參愈傷組織誘導芽的影響

3 結論與討論

本試驗結果表明，丹參愈傷組織誘導的最佳培養基為 MS＋1.0 mg/L 6-BA＋2.0 mg/L 2，4-D，其中，2，4-D對愈傷組織誘導的影響較大，濃度太低不利于誘導愈傷，濃度太高會影響后期愈傷質量，導致愈傷褐化；增加6-BA濃度可以提高出愈率，但愈傷質量較低。

試驗結果表明，誘導愈傷分化芽的最適培養基為MS＋2.0 mg/L 6-BA＋0.25 mg/L NAA，試驗中發現，單獨使用6-BA不利于誘導芽，與一定濃度的NAA配比使用能較高效率地誘導芽。

本研究探索了不同激素種類和濃度配比對丹參愈傷組織誘導芽的影響，為丹參提供了一套高效、快速、穩定的繁殖方法，進而為丹參的快速繁殖提供了技術支持。