金柑CHS和CHI基因的克隆及表達(dá)分析

馬小迪，譚嫣，王久照，劉小剛，曾明*

(1.西南大學(xué) 園藝園林學(xué)院，重慶 400715； 2.南方山地園藝學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715)

金柑(FortunellacrassifoliaSwingle.)，蕓香科金柑屬植物。金柑植株發(fā)育童期短，當(dāng)年抽生枝條即可開(kāi)花結(jié)果，具有一年多次開(kāi)花結(jié)果的特性；金柑果實(shí)顏色金黃，在春節(jié)前后成熟，寓意吉祥喜慶；味道甘甜可口，作為少見(jiàn)的帶皮食用型柑橘類(lèi)中國(guó)特色水果，風(fēng)味獨(dú)特，其營(yíng)養(yǎng)與醫(yī)藥保健功能受到廣泛關(guān)注。

類(lèi)黃酮(flavonoids)是重要的一類(lèi)多功能性次生代謝產(chǎn)物，在植物中具有抗病原菌、抗UV、抗鹽、抗旱等作用，也是一種對(duì)人體有益的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。已有報(bào)道對(duì)葡萄[1]、梨[2]、草莓[3]等類(lèi)黃酮的合成進(jìn)行了研究。金柑雖為柑橘近緣屬植物，但在類(lèi)黃酮組成含量上具有差異性。柑橘以黃烷酮和黃酮為主[4-5]，主要存在于血橙中的花青苷和檸檬中的黃酮醇[6]等，而金柑含有豐富的二氫查爾酮和根皮素-3′,5′-二碳葡萄糖苷[7-8]，是研究類(lèi)黃酮合成的一種特色材料。

目前，對(duì)金柑的研究主要集中在栽培管理與保鮮技術(shù)、活性物質(zhì)的含量檢測(cè)與提取利用等方面，對(duì)抗逆基因和開(kāi)花基因僅進(jìn)行了初步研究。徐志龍等[9]研究了不同砧木對(duì)陽(yáng)朔金柑樹(shù)體和果實(shí)品質(zhì)的影響；周翡云等[10]對(duì)融安金柑結(jié)果母枝質(zhì)量與果實(shí)品質(zhì)進(jìn)行了相關(guān)性分析；Kondo等[11]研究了環(huán)境因子對(duì)金柑抗氧化活性的影響；Barreca等[12]對(duì)金柑類(lèi)黃酮的抗氧化性能進(jìn)行了測(cè)定；龔小慶[13]以金柑為材料，克隆了3個(gè)抗逆基因，并且鑒定解析了基因的功能及其作用機(jī)制；胡穎[14]對(duì)融安金柑花器官發(fā)育轉(zhuǎn)錄特征進(jìn)行了分析，并研究了相關(guān)基因的功能；張奕[15]克隆了融安金柑開(kāi)花關(guān)鍵基因，并對(duì)其功能進(jìn)行了初步分析。

類(lèi)黃酮通過(guò)苯丙烷途徑(phenylpropanoid pathways)進(jìn)行生物合成，是次生代謝研究的主要方向。查爾酮合成酶(chalcone synthase，CHS)和查爾酮異構(gòu)酶(chalcone isomerase，CHI)是類(lèi)黃酮合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶。查爾酮合成酶催化3分子丙二酰-CoA和1分子對(duì)香豆酰-CoA縮合形成查爾酮，是類(lèi)黃酮合成的重要限速步驟[16-17]。查爾酮異構(gòu)酶催化柚皮苷查爾酮異構(gòu)化，形成生物活性二羥基黃烷酮，該酶是第1個(gè)被認(rèn)識(shí)的黃酮類(lèi)化合物合成相關(guān)酶。CHS和CHI基因已從很多植物中被克隆且進(jìn)行了功能鑒定，如金魚(yú)草、碧冬茄、玉米、圓葉牽牛、非洲菊、擬南芥和小立碗蘚[18-26]。

近年來(lái)，生物活性物質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)研究已成為果實(shí)品質(zhì)研究的一個(gè)熱點(diǎn)，但對(duì)金柑類(lèi)黃酮合成相關(guān)基因的克隆與表達(dá)研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究從金柑中分離CHS和CHI編碼基因，通過(guò)qRT-PCR(quantitative real time polymerase chain reaction)定量分析它們?cè)诠麑?shí)成熟過(guò)程中的表達(dá)模式，進(jìn)一步分析基因表達(dá)與類(lèi)黃酮積累的相關(guān)性，探索類(lèi)黃酮生物合成途徑中關(guān)鍵基因的遺傳調(diào)控機(jī)制，以期為金柑類(lèi)黃酮的合成機(jī)理研究提供基礎(chǔ)信息，對(duì)調(diào)控柑橘次生代謝產(chǎn)物合成、提高類(lèi)黃酮產(chǎn)量提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

實(shí)驗(yàn)材料為不同發(fā)育階段的瀏陽(yáng)金柑果實(shí)，采集于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑橘研究所國(guó)家果樹(shù)種質(zhì)重慶柑橘圃，樹(shù)齡約10年。于花后15、31、69、99、130及156 d采集果實(shí)樣品，其中花后15和31 d的果實(shí)，由于果皮和果肉不能有效分離，所以將果實(shí)作為整體進(jìn)行分析，而其他時(shí)期果實(shí)的果皮和果肉分別進(jìn)行分析。樣品采集后，置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 類(lèi)黃酮測(cè)定

稱(chēng)取烘干樣品0.5 g于10 mL離心管，加入10 mL 70%乙醇，混勻，超聲破碎30 min(功率60%，水溫45 ℃)，濾液濃縮除去有機(jī)溶劑，用4 mL蒸餾水定容備用。取適當(dāng)稀釋的1 mL待測(cè)液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加入0.3 mL 5% NaNO2，搖勻；靜置10 min后加入0.3 mL 10% AlCl3，搖勻；放置10 min后再加入2 mL 4% NaOH，搖勻；最后用60%乙醇定容至10 mL，15 min后于510 nm測(cè)定吸光值。以蘆丁作為標(biāo)樣制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.3 qRT-PCR定量分析

采用大連寶生物公司的MiniBEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒提取果實(shí)總RNA，用天根公司FastQuant RT Super Mix試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，隨后基于SYBR法對(duì)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)，內(nèi)參基因?yàn)锳ctin。

表1 用于qRT-PCR分析的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆及其序列特征

使用以下流程，獲取金柑CHS和CHI編碼序列。第一步，以擬南芥CHS和CHI蛋白為Query序列，用BlastP工具檢索甜橙和克萊門(mén)氏小柑橘的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)。在克萊門(mén)氏小柑橘蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中，發(fā)現(xiàn)了4個(gè)候選CHS和2個(gè)候選CHI，而在甜橙中界定了同樣數(shù)量的CHS和CHI，隨后從NCBI中獲取相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本序列。第二步，使用HISAT軟件，以上述候選CHS和CHI轉(zhuǎn)錄本序列為模板，從實(shí)驗(yàn)室之前測(cè)序完成的金柑果實(shí)轉(zhuǎn)錄組中獲取編碼CHS和CHI的reads。第三步，使用Trinity軟件將這些reads組裝成完整的轉(zhuǎn)錄本序列；第四步，對(duì)于不完整的轉(zhuǎn)錄本，采用FPNI-PCR進(jìn)行序列補(bǔ)齊。最終，在金柑中界定了3個(gè)候選CHS(FmCHS1～FmCHS3)和2個(gè)金柑CHI(FmCHI1和FmCHI2)。FmCHS1、FmCHS2和FmCHS3分別編碼390個(gè)、391個(gè)和391個(gè)氨基酸殘基多肽，預(yù)測(cè)分子量為42.61、42.66和42.73 ku，等電點(diǎn)為5.71、6.28和5.70。FmCHI1和FmCHI2，分別編碼222和209個(gè)氨基酸殘基多肽，預(yù)測(cè)分子量為23.99和23.20 ku，等電點(diǎn)為5.15和5.00。

2.2 基于進(jìn)化樹(shù)的功能預(yù)測(cè)

采用近鄰相接法(Mega 6.0)，分別構(gòu)建FmCHS和FmCHI氨基酸序列進(jìn)化樹(shù)(圖1和圖2)。基于進(jìn)化聚類(lèi)關(guān)系(圖1)，F(xiàn)mCHS1和FmCHS2能與已知功能CHS緊密聚為一類(lèi)，界定為CHS蛋白；而FmCHS3單獨(dú)聚類(lèi)，界定為CHS-like蛋白。

已有研究表明，CHI蛋白能夠被分為4種類(lèi)型。類(lèi)型Ⅰ(Type Ⅰ)廣泛存在于維管植物，而類(lèi)型Ⅱ(Type Ⅱ)為豆科植物所特有[27]。這兩類(lèi)CHI蛋白都屬于bona fide CHI，具有CHI酶催化活性，參與植物類(lèi)黃酮合成。類(lèi)型Ⅲ(Type Ⅲ)在擬南芥中被顯示為脂肪酸束縛蛋白(fatty acid-binding proteins，F(xiàn)APs)，而類(lèi)型Ⅳ(Type Ⅳ)在擬南芥中與類(lèi)型Ⅰ的CHI蛋白互作促進(jìn)類(lèi)黃酮合成。基于進(jìn)化聚類(lèi)關(guān)系(圖2)，F(xiàn)mCHI1界定為類(lèi)型Ⅰ CHI蛋白，而FmCHI2界定為類(lèi)型Ⅳ CHI蛋白。

圖1 基于CHS基因的編碼蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)

圖2 基于CHI基因的編碼蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)

2.3 基因表達(dá)與類(lèi)黃酮含量的關(guān)系

為進(jìn)一步明確CHS和CHI基因在果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中對(duì)類(lèi)黃酮生物合成所起的作用，分別檢測(cè)金柑果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中果皮和果肉的類(lèi)黃酮含量，并通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)基因在同一時(shí)期的表達(dá)水平。從圖3可以看出，在花后15、69 d果實(shí)中類(lèi)黃酮含量最高；從花后69 d開(kāi)始，隨著果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育，金柑果皮中類(lèi)黃酮含量呈現(xiàn)明顯下降，而果肉中類(lèi)黃酮含量呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)；但總體而言，果皮中的類(lèi)黃酮含量始終高于果肉中類(lèi)黃酮含量。

P，果皮；R，果肉。圖3～4同

qRT-PCR結(jié)果顯示(圖4)，在金柑果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，F(xiàn)mCHS1基因呈先高后低的表達(dá)趨勢(shì)，在15和31 d果實(shí)中表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他時(shí)期；而FmCHS2則呈降、升、降的變化趨勢(shì)，其中在69 d果肉和99 d果皮中表達(dá)量高于其他組織或時(shí)期；FmCHS3表達(dá)量在整個(gè)果實(shí)發(fā)育過(guò)程中沒(méi)有明顯變化，始終處于低水平、波動(dòng)的表達(dá)模式。在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，F(xiàn)mCHI1的表達(dá)在早期緩慢下降，之后呈低水平、波動(dòng)的表達(dá)模式；而FmCHI2呈先上升后下降的變化模式。

圖4 金柑果實(shí)中3個(gè)FmCHS(A)2個(gè)FmCHI (B) 基因的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

查爾酮合成酶和查爾酮異構(gòu)酶的有關(guān)研究已成為一個(gè)熱點(diǎn)，但大多以模式植物和少數(shù)作物為研究對(duì)象。在擬南芥中，具催化活性的CHS(tt4，At5G13930)和CHI(tt5，At3G55120)都是單基因編碼，且功能已驗(yàn)證。在此基礎(chǔ)上，目前的研究逐漸深入到CHS和CHI基因上游調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的挖掘及翻譯后修飾。例如，最近在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)能夠與CHS蛋白互作的KFBCHS蛋白，介導(dǎo)CHS的泛素化及降解[28]。KFBCHS的表達(dá)顯示了組織特異性及時(shí)空特異性，并對(duì)各種光信號(hào)具有很強(qiáng)的響應(yīng)。擬南芥At5G05270基因編碼類(lèi)型Ⅳ CHI，這類(lèi)CHI蛋白本身并無(wú)催化活性，但它能與類(lèi)型Ⅰ CHI蛋白互作，提升擬南芥中花青素及類(lèi)黃酮含量[29-30]。

然而，一些雙子葉植物CHS和CHI由多基因編碼，使得進(jìn)一步深入研究變得困難。通過(guò)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行聚類(lèi)分析，本實(shí)驗(yàn)從金柑中界定了3個(gè)CHS，F(xiàn)mCHS1和FmCHS2能與已知功能CHS緊密聚為一類(lèi)，界定為CHS蛋白；而FmCHS3單獨(dú)聚類(lèi)，界定為CHS-like蛋白。最近一項(xiàng)研究，在蘋(píng)果基因組中界定了3個(gè)CHS(MdCHS1、MdCHS2及MdCHS3)，體外酶活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)這3個(gè)基因均具有催化活性[31]。此外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FmCHI1能與擬南芥CHI/TT5聚類(lèi)，這個(gè)基因可能具有催化活性，F(xiàn)mCHI2界定為類(lèi)型Ⅳ CHI蛋白。基于前人的研究結(jié)果，我們推測(cè)FmCHI2能與FmCHI1互作，進(jìn)而促進(jìn)類(lèi)黃酮的合成，但仍有待通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)等對(duì)其進(jìn)行功能驗(yàn)證。

CHS和CHI是類(lèi)黃酮合成途徑中兩個(gè)關(guān)鍵酶，定位于整個(gè)途徑上游。從理論上講，下游類(lèi)黃酮合成都受這兩個(gè)酶的影響。大量研究表明，CHS和CHI基因的表達(dá)與類(lèi)黃酮含量呈現(xiàn)密切關(guān)系。最經(jīng)典的例子為擬南芥tt4和tt5突變體互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，Dong等[32]將玉米的CHS(C2)和CHI(CHI1)基因分別導(dǎo)入擬南芥tt4和tt5突變體，發(fā)現(xiàn)植物能夠積累類(lèi)黃酮和花青素。相似的情況也發(fā)生在將小蒼蘭CHS(FhCHS1)導(dǎo)入擬南芥tt4突變體[33]。在將FhCHS1導(dǎo)入矮牽牛時(shí)，發(fā)現(xiàn)矮牽牛花色由白色變?yōu)榉奂t色[23]。在銀杏中，CHS表達(dá)水平與類(lèi)黃酮含量之間呈顯著正相關(guān)[34]。在本研究中，F(xiàn)mCHS1、FmCHS2、FmCHI1和FmCHI2在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中均存在一個(gè)階段性高表達(dá)，并與類(lèi)黃酮積累顯示一定的相關(guān)性，說(shuō)明這幾個(gè)基因在金柑類(lèi)黃酮生物合成中具有重要作用。在金柑果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，F(xiàn)mCHS1和FmCHI1表達(dá)量較高，與類(lèi)黃酮積累模式最為接近，因此，它們可能直接參與了金柑果實(shí)類(lèi)黃酮的合成。