傳染性漿膜炎病鴨免疫器官中Toll樣受體的分布與表達(dá)

趙芳娥，李寶臣，孟超，鄭道光，張才喬

(1.浙江大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058； 2.浙江詩華諾倍威生物有限公司，浙江 杭州 310018)

鴨傳染性漿膜炎(Riemerellaanatipestifer，RA)又稱鴨疫里默氏桿菌病，是一種侵害鴨、鵝、火雞等多種禽類的細(xì)菌性疾病[1-2]，主要感染2～7周齡雛鴨，常與其他細(xì)菌混合感染，嚴(yán)重影響?zhàn)B鴨業(yè)的發(fā)展，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。目前，疫苗免疫是預(yù)防和控制鴨傳染性漿膜炎的有效措施，但鴨疫里默氏桿菌血清型復(fù)雜，不同血清型之間交叉保護(hù)較低或缺乏，導(dǎo)致疫苗免疫失效。

機(jī)體的天然免疫系統(tǒng)是防御病原體入侵的第一道防線，動(dòng)物機(jī)體表達(dá)不同的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRRs)，識(shí)別病原體相關(guān)分子，從而引發(fā)、活化抗病毒基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)宿主抵抗病原體的防御功能[4]。禽類PRRs已經(jīng)被鑒定，其中Toll樣受體是禽類先天免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵組分，在禽類傳染病的預(yù)防、控制方面極其重要[5]。Toll樣受體作為病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)的感受器，是介導(dǎo)宿主對(duì)各種病原體識(shí)別、產(chǎn)生免疫和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵分子，激活時(shí)不僅會(huì)誘導(dǎo)天然免疫應(yīng)答，同時(shí)還能激活獲得性免疫系統(tǒng)。在機(jī)體抵抗病原體研究方面，Toll樣受體2(toll-like receptors 2，TLR2)、Toll樣受體4(toll-like receptors 4，TLR4)是最為重要的2類受體。TLR2可特異性識(shí)別細(xì)菌表面的脂蛋白。TLR4能夠特異性識(shí)別革蘭氏陰性菌的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)[6-7]，特異性識(shí)別LPS后，其胞外部分與LPS結(jié)合形成復(fù)合物，形成的Toll樣受體—LPS復(fù)合物引起胞內(nèi)Toll樣受體C端TIR區(qū)招募胞漿內(nèi)的接頭蛋白，然后通過一系列酶生化反應(yīng)，促進(jìn)核轉(zhuǎn)錄因子κB(transcription factor κB，NF-κB)的核轉(zhuǎn)位，NF-κB進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)可對(duì)多種炎癥因子基因及免疫相關(guān)基因進(jìn)行表達(dá)調(diào)控[8-9]，激活天然免疫[10]。參與獲得性免疫應(yīng)答的輔助性T細(xì)胞1/2可被細(xì)胞因子和共刺激分子激活后增殖、分化，進(jìn)一步會(huì)啟動(dòng)機(jī)體的獲得性免疫系統(tǒng)[11-12]。

本研究將25日齡雛鴨人工染病，在感染24 h后采集免疫器官組織樣品，運(yùn)用免疫組化和免疫印跡方法測(cè)定組織中Toll樣受體的分布與表達(dá)，qRT-PCR檢測(cè)部分細(xì)胞因子mRNA豐度的變化，旨在探索雛鴨天然免疫系統(tǒng)抵抗鴨疫里默氏桿菌感染的機(jī)理，為研究新型高效疫苗提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

鴨疫里默氏桿菌血清1型SG4株由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，25日齡雛鴨(紹興麻鴨)由紹興某種鴨場(chǎng)提供。

4%多聚甲醛、兔抗-Toll樣受體2多克隆抗體(BS7380)、兔抗-Toll樣受體4多克隆抗體(BS3489)、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG等購自巴傲德生物科技有限公司；SABC試劑盒、DAB顯色液、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒等購自武漢博士德生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 處理設(shè)計(jì)

隨機(jī)選取鴨傳染性漿膜炎血清抗體陰性的雛鴨21羽，攻毒組5羽，對(duì)照組2羽，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。攻毒組每羽雛鴨腿部肌肉注射1.0×1010CFU的鴨疫里默氏桿菌SG4株菌液，攻毒后觀察雛鴨發(fā)病和死亡情況。

1.2.2 樣品采集

將攻毒組病變明顯的雛鴨和對(duì)照組雛鴨頸動(dòng)脈放血處死，摘取脾臟和法氏囊，固定于4%多聚甲醛溶液中備用。

1.2.3 組織學(xué)觀察

取脾臟和法氏囊，制作5 μm厚度石蠟切片，HE染色并在顯微鏡下觀察。石蠟切片脫蠟至水，進(jìn)行免疫組化染色，制片并在顯微鏡下觀察，檢測(cè)TLR2、TLR4在鴨脾臟、法氏囊中的分布。

1.2.4 細(xì)胞因子檢測(cè)

用Trizol提取脾臟、法氏囊組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為PCR模板，根據(jù)GenBank檢索的TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10、β-actin基因編碼序列設(shè)計(jì)引物(表1)，使用熒光定量試劑盒進(jìn)行Real-time PCR。以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，2-△△Ct定量細(xì)胞因子。

表1 基因編碼序列設(shè)計(jì)引物的信息

1.2.5 Western blot檢測(cè)鴨脾臟、法氏囊中TLR2、TLR4的表達(dá)

使用RIPA蛋白裂解液提取總蛋白，并用BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，將各組蛋白濃度調(diào)至一致，加入蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min后保存。取10 μL蛋白樣品進(jìn)行Western blot試驗(yàn)，將TLR2、TLR4抗體1∶1 000稀釋，以β-actin為內(nèi)參，檢測(cè)TLR2、TLR4蛋白的表達(dá)情況。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism軟件作圖，SPSS統(tǒng)計(jì)分析，單因素方差分析比較結(jié)果，P<0.05表示差異顯著，P<0.01差異極顯著，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫器官組織病理學(xué)變化

脾臟組織病理學(xué)變化見圖1。與對(duì)照組相比，攻毒組雛鴨脾臟腫大，表面有纖維素膜，呈現(xiàn)出大理石狀。脾臟紅髓充血、出血，竇顯著擴(kuò)張、淋巴細(xì)胞排列散亂。脾臟白髓萎縮，淋巴細(xì)胞稀散，中央動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞顯著腫脹，脾小體中淋巴細(xì)胞變性、壞死，細(xì)胞散亂，細(xì)胞間隙增加，組織結(jié)構(gòu)疏松。

rp，紅髓；wp，白髓；sn，脾小體；ss，脾血竇；ca，中央動(dòng)脈

法氏囊的組織病理學(xué)變化見圖2。攻毒組雛鴨法氏囊黏膜上皮嚴(yán)重破損，上皮微絨毛斷裂、脫落于管腔；淋巴濾泡皮質(zhì)變薄，淋巴細(xì)胞減少，髓質(zhì)細(xì)胞嚴(yán)重變性、壞死、溶解，濾泡中心出現(xiàn)大小不一的空泡，網(wǎng)狀細(xì)胞增多。許多淋巴細(xì)胞胞質(zhì)、胞核濃縮，出現(xiàn)細(xì)胞退行性變化。

bn，腔上囊小結(jié)；co，皮質(zhì)；me，髓質(zhì)；*，空泡；→，粘膜上皮

2.2 TLR2、TLR4在鴨脾臟、法氏囊中的分布

TLR2、TLR4在鴨脾臟中分布見圖3～4。TLR4在鴨脾臟紅髓和白髓都有分布，且白髓主要分布于中央動(dòng)脈周圍。當(dāng)鴨感染傳染性漿膜炎后，與對(duì)照組相比較，TLR4分布于整個(gè)細(xì)胞質(zhì)，白髓脾小體中出現(xiàn)TLR4，中央動(dòng)脈周圍TLR4分布顯著增多。

如圖5所示，TLR2、TLR4主要分布于法氏囊的黏膜上皮和腔上囊小結(jié)。攻毒后，空泡化的腔上囊小結(jié)中分布大量的TLR4。

2.3 TLR2、TLR4在鴨脾臟、法氏囊中的表達(dá)

如圖6所示，TLR2在鴨脾臟中不表達(dá)。法氏囊中，各組TLR2表達(dá)量無顯著差異。TLR4在鴨脾臟中表達(dá)，攻毒后表達(dá)量顯著高于對(duì)照組；而在正常法氏囊中TLR4的表達(dá)量很低，但攻毒后極顯著的增加。

2.4 鴨攻毒后免疫器官中炎癥因子表達(dá)的變化

Real-time PCR檢測(cè)鴨攻毒后脾臟、法氏囊中TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10等炎癥因子mRNA表達(dá)差異。結(jié)果(圖7)顯示：攻毒組與對(duì)照組相比，脾臟和法氏囊TNF-α、IL-2、IL-6顯著性的升高；而IL-10差異不顯著。

rp，紅髓；wp，白髓；sn，脾小體；ca，中央動(dòng)脈

圖4 鴨脾臟TLR2分布定位

→，黏膜上皮；bn，腔上囊小結(jié)

**表示差異極顯著(P<0.01)。圖7同

圖7 鴨脾臟和法氏囊中炎癥相關(guān)因子的表達(dá)

3 討論

鴨傳染性漿膜炎是我國(guó)養(yǎng)鴨場(chǎng)常發(fā)、難以防治、造成養(yǎng)鴨業(yè)經(jīng)濟(jì)損失較為嚴(yán)重的傳染病之一。多年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)鴨傳染性漿膜炎的流行病學(xué)、血清學(xué)分型、臨床診斷及防治等進(jìn)行了較深入的研究[13-15]。然而，在疫苗免疫過程中，由于鴨疫里式桿菌血清型復(fù)雜，且不同血清型之間交叉保護(hù)缺乏，常導(dǎo)致免疫失敗[16]。當(dāng)細(xì)菌、病毒等病原體感染動(dòng)物機(jī)體時(shí)，先天性免疫是機(jī)體抵御入侵病原微生物的第一道防線。宿主細(xì)胞通過特定模式識(shí)別受體，識(shí)別不同類型的病原微生物，繼而激活一系列級(jí)聯(lián)信號(hào)通路，建立宿主的天然免疫反應(yīng)[17]。模式識(shí)別受體中，Toll樣受體是比較重要的一種，禽類與哺乳動(dòng)物這2類脊椎動(dòng)物的Toll樣受體可識(shí)別相似的微生物產(chǎn)物。目前，在禽類疾病中相關(guān)的研究還很少[18-19]。本試驗(yàn)對(duì)25日齡鴨人工感染傳染性漿膜炎強(qiáng)毒SG4株后，對(duì)鴨免疫器官脾臟和法氏囊的TLR2、TLR4的表達(dá)與分布定位進(jìn)行研究。已有研究發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)炎癥可導(dǎo)致TLR4表達(dá)顯著增加[20]。當(dāng)動(dòng)物機(jī)體通過Toll樣受體識(shí)別病原微生物后，最終可通過多條信號(hào)通路誘導(dǎo)大量炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而形成一系列炎癥反應(yīng)[21]。本研究證明，鴨疫里默氏桿菌可誘導(dǎo)雛鴨免疫器官中TLR4表達(dá)顯著增高，攻毒組雛鴨免疫器官中主要是通過激活TLR4的內(nèi)吞作用繼而誘導(dǎo)TNF-α、IL-2、IL-6等炎癥因子的表達(dá)，繼而激活宿主天然免疫系統(tǒng)。以上結(jié)果提示，TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路在雛鴨抵抗病原菌感染中發(fā)揮重要作用。