普境安對細粒棘球絳蟲蟲卵的作用效果

郝力力，陽愛國，袁東波，郭莉，侯巍，莫茜，尹杰，張朝輝，徐林，余勁，王瀟，何能杰，李銳

(1.西南民族大學 生命科學與技術學院，四川 成都 610041； 2.四川省動物疫病預防控制中心，四川 成都 610041；3.甘孜州動物疫病預防控制中心，四川 甘孜 626000； 4.河南普愛飼料股份有限公司，河南 商水 466100；5.成都杰鑫瑪生物科技有限公司，四川 成都 610041； 6.浙江省農業科學院 農產品質量標準研究所，浙江 杭州 310021)

四川省甘孜州是全世界包蟲病高發地區，包蟲病不僅嚴重危害當地居民健康，而且導致很多包蟲病患者所在家庭因病返貧，嚴重制約了當地社會經濟的發展。細粒棘球絳蟲屬于圓葉目，犬科動物(家犬、流浪犬、狼、狐)是終末宿主和唯一傳染源[1-2]。成蟲在犬科動物小腸內發育成熟，排出蟲卵，蟲卵內含六鉤蚴，對人和其他中間宿主(牛、羊)具有感染力。值得注意的是，細粒棘球絳蟲的蟲卵對外界不良環境抵抗力很強，尤其耐受低溫：-80 ℃ 7 d方能徹底滅活，7 ℃可存活200 d以上，21 ℃可存活50 d[3-4]。甘孜州大部分地區屬亞寒帶高原氣候，全年氣溫偏低，日照長，晝夜溫差大，非常適合環境中細粒棘球絳蟲蟲卵的長期存活。此外，甘孜州全州總計18個縣，牧業縣占比高，牧民家家養犬，陽性犬只的糞便極易污染牧場、地表水源以及周邊居住環境，導致人畜容易從環境中攝入蟲卵而感染包蟲病。因此，鑒于上述情況，迫切需要一種高效的消毒劑，對環境中的蟲卵進行抑制殺滅，降低人畜攝入蟲卵的風險，保障當地居民的健康。

普境安(Stalosan F)是由丹麥Stormollen公司研發的一款干粉生物安全衛生產品，對各種病原微生物均有較好的殺滅抑制效果。該產品采用特殊的加工工藝，將所有成分加工到接近納米級微粒再進行結合，最終產品呈超微粒狀態。普境安可采用專門的噴灑設備，按照所需覆蓋面積來計算所用劑量，均勻覆蓋于物體表面，可強力吸附環境中的病原體，從而徹底破壞微生物的生存環境，達到抑制、殺滅病原微生物的目的[5]。普境安對人畜無任何副作用，已上市50多年，對雞球蟲、豬蛔蟲等寄生蟲蟲卵、蒼蠅蟲卵、真菌(曲霉菌、黃曲霉菌等)、細菌(大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等)和病毒(禽流感、藍耳病、犬細小病毒和豬細小病毒等)均有較好的控制效果[6]。因此，本實驗擬就普境安對細粒棘球絳蟲蟲卵的抑制、殺滅效果展開初步研究，確定普境安能否有效地殺滅細粒棘球絳蟲蟲卵或者減低蟲卵的活力，從而為提高包蟲病流行地區公共衛生水平、保障當地居民健康提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

主要儀器設備和試劑。臺式高速離心機(eppendorf 5402型)、ABI7500熒光PCR儀、Nanodrop 2000、TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix(北京全式金公司)、Trizol(Invitrogen)，引物和探針由華大基因合成。

犬糞樣本的采集。于2017年9月，在石渠縣采集驅蟲后3 d內的新鮮家犬糞便30份，每份150 g左右，4 ℃冷藏保存。

1.2 處理設計

陽性犬糞的篩選。將30份犬糞每份均充分混勻，每份取100 mg按照Trizol說明書提取總RNA備用。針對細粒棘球絳蟲ND1基因，設計合成以下引物和探針(MGB)：Pf: 5′-TGTACTGGTTGG GGTGGTTACAA-3′；Pr:5′-GCCTCAAACCTAACAG ATCCAAAA-3′；Probe: 5′-CACATCGAACAGACCT T-3′。采用上述引物和探針，建立如下PCR反應體系：上下游引物各3 μL(終濃度600 nmol·L-1)、探針1 μL(終濃度400 nmol·L-1)、PCR Mix 12.5 μL、RNA 3～4 μL(10 ng)、ddH2O補齊至25 μL。于ABI7500熒光PCR儀上運行反應，選取Ct值小于20的犬糞樣本備用。

普境安對蟲卵最佳作用效果對應劑量和處理時間的確定。選取Ct值小于20的犬糞樣本1份，將普境安分為50、80和100 g·m-23個劑量組，處理時間分別為4、8、12和24 h，同時設置1個空白對照組(未用普境安處理)，總計4個實驗組(圖1)。每組取犬糞6 g，均勻平攤于90 mm無菌平皿內，按照對應劑量將普境安均勻覆蓋于犬糞上，溫箱內18 ℃下放置。在4個時間點，每組分別取大約1 g犬糞提取總RNA，按照上述反應體系進行檢測，做3個復孔，確定Ct值。

1.3 數據分析

采用SPSS 19.0對不同處理組和空白對照組的Ct值進行卡方分析，判定是否存在顯著差異。

2 結果與分析

結果如表1所示，對照組在4、8、12和24 h Ct值變化區間為18.32～19.45，無明顯變化；和對照組相比，50 g·m-2劑量組4個時間段Ct值無明顯變化；80 g·m-2劑量組在12和24 h有明顯變化，其中作用24 h后差異顯著(P<0.05)；100 g·m-2劑量組在作用8、12和24 h后Ct值有明顯變化，其中作用12和24 h后差異極顯著(P<0.01)。

表1 不同普境安處理組作用不同時間后對應的Ct值

注：*、**分別表示與對照相比差異達到顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)水平。

3 討論

普境安對寄生蟲蟲卵的抑制機理主要為以下2方面：1)其納米級成分(硅酸鹽成分)可滲透至蟲卵內部，改變其內部的pH值，從而干擾DNA的復制，切斷了幼蟲的發育過程；2)普境安顆粒改變了蟲卵表面的通透性，造成了內部水分的流失，蟲卵脫水死亡，達到了抑制和殺滅的作用。Permin等[6]將普境安處理過的雞蛔蟲、雞異刺線蟲和封閉毛細線蟲的蟲卵接種雞后，和未處理組相比，雞體內成蟲數量明顯減少，說明普境安對蟲卵有亞致死作用，能夠一定程度上抑制蟲卵發育為感染性幼蟲。Ralph等[7]發現，采用50 g·m-2劑量作用于未孢子化的堆型艾美耳球蟲卵囊48 h后，和對照組相比，孢子化率下降了50%。

本實驗中發現，100 g·m-2作用24 h后，犬糞中細粒棘球絳蟲蟲卵ND1基因轉錄水平顯著降低，表明對蟲卵活力有顯著的抑制作用。甘孜州18個縣均為包蟲病流行區域，前期相關調查發現，土壤、犬被毛上均檢出蟲卵[7]，因此，采用普境安對定居點周邊土壤、草場以及人活動的廣場等重點區域進行消毒，是降低人畜感染包蟲的有效措施。細粒棘球絳蟲的蟲卵與球蟲、蛔蟲蟲卵(需要在外界環境中進行發育：球蟲孢子化，蛔蟲蟲卵進一步分裂，有明顯的形態變化)不同，排出到外界環境中時就已經發育成熟，形態上不再有明顯變化，因此，無法直接從形態上判定普境安對蟲卵的抑制效果。在后續研究中，可從犬糞中分離富集細粒棘球絳蟲蟲卵，按照不同劑量/時間組合作用后，接種中間宿主綿羊，依據綿羊體內臟器上包囊個數及發育程度來進一步確定普境安最佳劑量/作用時間組合。由于細粒棘球絳蟲蟲卵對人和家畜有感染性，因此，對綿羊的攻蟲實驗至少需要在BSL-2實驗室進行，這也是目前未能開展動物實驗的主要原因。

由于普境安的特殊作用機制，即使長期使用，病原微生物也不會產生抗藥性；和其他消毒劑不同，普境安即使在有機物存在的條件下，也能充分發揮作用，而且可以進行帶畜消毒，對人畜無害(吸入、食入、皮膚接觸及眼部接觸均無害)，不會產生生態破壞，非常適合包蟲病流行地區使用。到目前為止，普境安對細粒棘球絳蟲蟲卵殺滅抑制效果國內尚無相關報道，本實驗進行了前期研究，以期為包蟲病的防控提供行之有效的技術措施。